[发明专利]奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒及其构建方法和应用

权利要求书

1.奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒，其特征是，增强型绿色荧光蛋白通用表达载体pEGFP-N1质粒的HindIII和SacII多克隆位点处插入TAP基因，且pEGFP-N1质粒的CMV启动子序列替换为BLG基因启动子序列；所述的TAP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的BLG基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒的构建方法，其特征是，包括以下步骤：

采用HindIII和SacII对pEGFP-N1质粒进行双酶切，将酶切后的pEGFP-N1质粒通过同源重组和TAP基因进行连接，构建重组质粒pEGFP-N1-TAP；

采用AseI和HindIII对重组质粒pEGFP-N1-TAP进行双酶切，切除pEGFP-N1载体原有的CMV启动子序列，将BLG启动子基因序列同源重组替换到AseI和HindIII酶切位点，构建奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒pBLG-EGFP-N1-TAP。

3.根据权利要求2所述的奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒的构建方法，其特征是，所述TAP基因的制备方法包括：

提取奶牛乳腺上皮细胞总RNA；

将奶牛乳腺上皮细胞总RNA反转录成cDNA；

以奶牛乳腺上皮细胞cDNA为模板，以P1、P2为奶牛TAP引物，RT-PCR扩增TAP基因编码序列；

其中，所述P1引物具有序列表中SEQ ID No:4所示的核苷酸序列，所述P2引物具有序列表中SEQ ID No:5所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒的构建方法，其特征是，所述RT-PCR扩增体系为：模板cDNA为1µl，P1、P2引物各1µl，Takara primeSTARMIX为10µl，ddH₂O补足至20µl；P1、P2引物的浓度均为0.1nmol/µl。

5.根据权利要求3所述的奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒的构建方法，其特征是，所述RT-PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，52℃退火20s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸7min。

6.根据权利要求2所述的奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒的构建方法，其特征是，所述BLG启动子基因的制备方法包括：

提取奶牛血液基因组DNA ；以奶牛血液基因组DNA为模板，以P3、P4为奶牛BLG引物，PCR扩增BLG启动子基因；

其中，所述P3引物具有序列表中SEQ ID No:6所示的核苷酸序列，所述P4引物具有序列表中SEQ ID No:7所示的核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述的奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒的构建方法，其特征是，所述PCR扩增体系为：模板DNA为1μl， P3、P4引物各1μl，Takara primeSTAR MIX为10μl，dH₂O补足至20μl，P3、P4引物的浓度均为0.1nmol/µl。