[发明专利]奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒及其构建方法和应用

说明书

本发明提供一种奶牛气管抗菌肽基因（TAP）乳腺特异性表达质粒及其构建方法和应用。具体地，PCR扩增TAP基因的编码序列，将其插入到携带增强的绿色荧光蛋白基因的通用表达载体pEGFP‑N1的多克隆位点中。通用表达载体pEGFP‑N1经Ase I+Hind III双酶切，去除CMV启动子，克隆奶牛乳腺特异性表达β‑乳球蛋白基因（BLG）启动子序列并取代Ase I和HindIII酶切位点，构建奶牛气管抗菌肽基因（TAP）乳腺特异性表达质粒。采用上述重组质粒转染奶牛乳腺上皮细胞,得到的细胞系可用于分泌具有生物活性的奶牛气管抗菌肽，用于奶牛乳腺组织免疫机制研究；该重组质粒还可应用于基因治疗奶牛乳房炎制剂的研发。

技术领域

本发明涉及一种奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒及其构建方法和应用，属于基因重组和分子克隆技术领域。

背景技术

奶牛乳腺炎是奶牛常见病和多发病，随着奶牛乳腺炎发病率上升,大大降低奶牛产奶量，并严重影响原料奶质量。因此，奶牛乳房炎的治疗越来越受重视。目前主要治疗手段是抗生素、中药制剂的药物治疗，而抗生素的使用，耐药菌株产生及乳中药物残留严重危害到消费者的健康，因此奶牛乳房炎的治疗以成为世界难题。少用或不用抗生素，有效控制药物残留，保证原料奶安全及奶牛产奶量是奶牛乳腺炎防控的主要目标。

气管抗菌肽(Tracheal antimicrobial peptide，TAP)是1991年发现的一种β-防御素，病原微生物和多种促炎因子均能特异性诱导TAP基因在奶牛乳腺组织表达上调，最大上调数十倍，增强了乳腺组织的防御能力。防御素具有广谱的抗菌活性和特殊抗菌机理，有关其基因工程、生物学活性及表达调控研究是当前国内外所普遍关注的，预计它将为解决日益严重的细菌耐药性问题提供强有力的帮助。某些哺乳动物防御素在提高巨噬细胞吞噬能力方面有很大的作用，可以促进成纤维细胞的有丝分裂，进而修复炎症部位的组织和细胞。人防御素对单核细胞具有强有效的趋化作用，并且在炎症反应中充当嗜中性粒细胞的趋化信号。当机体感染病原体时，某些类型的防御素表达上调，这有助于机体抵抗和杀死病原微生物。研究表明，使用细菌脂多糖刺激患有乳腺炎的小鼠的乳腺，可以导致小鼠乳腺中β-防御素1的表达量上调。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，构建一种奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒，在该质粒5’端构建乳腺特异性表达调控区，靶基因可以在乳腺组织中特异性表达，通过提高奶牛乳腺中气管抗菌肽这种天然抗菌物质的表达水平，为防治奶牛乳腺炎提供重要材料。

为实现上述发明目的，本发明提供一种奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒，增强型绿色荧光蛋白通用表达载体pEGFP-N1质粒的HindIII和SacII多克隆位点处插入TAP基因，且pEGFP-N1质粒的CMV启动子序列替换为BLG基因启动子序列；所述的TAP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的BLG基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供一种奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

采用HindIII和SacII对pEGFP-N1质粒进行双酶切，将酶切后的pEGFP-N1质粒通过同源重组和TAP基因进行连接，构建重组质粒pEGFP-N1-TAP；

采用AseI和HindIII对重组质粒pEGFP-N1-TAP进行双酶切，切除pEGFP-N1载体原有的CMV启动子序列，将BLG启动子基因序列同源重组替换到AseI和HindIII酶切位点，构建奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒pBLG-EGFP-N1-TAP。

进一步地，所述TAP基因的制备方法包括：