[发明专利]一种间充质干细胞旁分泌因子在制备疼痛药中的应用

权利要求书

1.一种间充质干细胞旁分泌因子的应用，用于制备治疗疼痛药物的应用。

2.按照权利要求1所述的应用，所述的间充质干细胞为来源于任意组织的间充质干细胞。来源包括脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊膜间充质干细胞等一切哺乳动物尤其人的各组织来源的间充质干细胞。

3.按照权利要求1所述的应用，所述的疼痛药物适合治疗各种不同病因导致的疼痛，具体包括：①、炎症、风湿、劳累等所有因素导致的颈、肩、腰、腿、膝关节疼痛；②、不明原因导致的神经疼痛；③、肌肉疼痛；④、各种因素导致的头痛；⑤、各种肿瘤伴随的疼痛。

4.按照权利要求1所述的应用，疼痛药的用法为：直接疼痛部位注射，静脉注射，肌肉注射，骨内注射，关节腔内注射，皮下注射或皮内注射。

5.按照权利要求4所述的应用，注射时载体可选自透明质酸、胶原蛋白、纤维黏连蛋白、层黏连蛋白、或者其他治疗相关的药物。

6.按照权利要求1所述的应用，其特征在于，以脐带间充质干细胞的获取方法为例，阐述间充质干细胞旁分泌因子的制备方法，包括以下步骤：

(1)取足月健康胎儿脐带，检测脐带血清HbsAg、抗-HCV、抗-HDV、抗-HEV、抗-HIV-1/2、HCV-RNA、HIV-1-RNA、CMV-DNA，检测结果均为阴性，可用；

(2)将生理盐水瓶用喷有酒精的纱布擦拭一遍后，去除瓶口处的封口塑料放入处于运行状态的洁净台中；

(3)脐带华通氏胶的剥离并洗涤；

优选:在生理盐水中洗涤去除脐带血渍，然后浸泡酒精消毒，再次用生理盐水洗涤，在装有生理盐水的培养皿中将将脐带剪成2-3cm小段，并用生理盐水洗涤清除脐带小段血管中的淤血和凝块；然后剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤；

(4)组织块制备

剪切脐带华通氏胶：将步骤(3)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-4mm的组织匀浆；用生理盐水洗涤组织匀浆，进行离心；

(5)接种

将步骤(4)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶如T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面；

(6)脐带华通氏胶的培养

平置步骤(5)接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有10wt％血清替代物的基础培养基即高糖DMEM培养基，然后缓慢让它浸润整个组织块；

培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％；

(7)换液

第一次换液：步骤(6)脐带华通氏胶培养到第6-7天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入等量的含有10％血清替代物的培养基，平置培养瓶，放置到从CO2培养箱中继续培养；

第二次换液：脐带华通氏胶培养到9-10天后，重复第一次换液的操作；

第三次换液：在镜像下观察细胞的生长状况，如果细胞融合度没有达到70-80％，在脐带华通氏胶培养到12-13天后，增加一次全量换液的操作；

(8)收获原代细胞

细胞观察：将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；

原代细胞收获

配置细胞消化液：按照体积比1:4的比例混合胰酶与生理盐水，混合液即为细胞消化液。

去除旧的培养液：轻轻摇晃培养瓶，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；

洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；

消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入消化液，使每个培养瓶的消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；

终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入间充质干细胞培养基，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，进行充分接触稀释，然后转移到离心管如50ml离心管中离心；

(9)原代细胞传代(P0传P1)

将上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入含有血清替代物的干细胞培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；

将重悬后的细胞悬液接种到培养瓶并用含有血清替代物的干细胞培养基定容到一定体积，使细胞达到一定浓度；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％。

种瓶：50000cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入培养基20ml；

按照上述传代方法依次传代，选取P3-P6代次的间充质干细胞；

间充质干细胞旁分泌因子的获取：

选取P3-P6代次的间充质干细胞，除去培养瓶中的培养基，并用生理盐水缓冲液清洗2-3次，然后吸尽培养瓶中生理盐水，加入含有5wt％血清替代物的高糖DMEM培养基，将含有细胞的培养瓶放置入2％氧浓度的低氧的培养箱中，培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％，继续培养48h，后收集间充质干细胞旁分泌因子悬液；

将上述间充质干细胞旁分泌因子悬液放入离心管，离心收取上清液，然后无菌滤器除菌过滤，即得所述用于治疗疼痛的间充质干细胞旁分泌因子。