[发明专利]脐带间充质干细胞的分离纯化方法

权利要求书

1.一种脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

分离脐带组织：取脐带组织，清洗去除血液，剪碎为组织碎片，备用；

组织消化：取上述组织碎片，加入组织消化液震荡消化；所述组织消化液中含有中性蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶II和DNA酶；消化结束后加入终止液终止，过滤，得未消化的组织块和滤液，将滤液离心去除上清获得细胞；

细胞培养：将上述组织块和细胞接种于培养瓶中，以无血清培养基进行培养，获得所述脐带间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，所述组织消化液包括：0.9％的NaCl，1.5-2.5mg/ml的中性蛋白酶，1.5-2.5mg/ml的透明质酸酶，1.5-2.5mg/ml的胶原酶II和1.5-2.5mg/ml的DNA酶。

3.根据权利要求2所述的脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，所述组织消化液的加入量为1.5±0.5ml组织消化液/1g脐带组织。

4.根据权利要求2所述的脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，组织消化步骤中，在37±2℃，200±30rpm震荡消化1-2h。

5.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，所述无血清培养基由无血清间充质干细胞培养基、5-15ng/ml的bFGF和2.5-7.5ng/ml的HGF组成。

6.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，所述细胞培养步骤中，当原代培养5-8天达到融合度75-85％进行传代培养，随后每3天传代一次，传代2-3代。

7.根据权利要求6所述的脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，所述细胞培养步骤中，传代时的传代比例为1:3-5。

8.根据权利要求6所述的脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，所述细胞培养步骤中，检测传代培养得到的脐带间充质干细胞表面标记物，待CD73、CD90、CD105阳性率均≥95％，CD34、CD45阳性率均≤5％，停止传代，收获细胞，即得。

9.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，所述分离脐带组织步骤之前，还包括脐带组织采集步骤，所述脐带组织采集步骤为：取胎盘组织，在组织保护液存在条件下0-4℃保存和/或运输。

10.根据权利要求9所述的脐带间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，所述组织保护液包括：生理盐水，20-30μg/ml的硫酸庆大霉素和2.5-7.5μg/ml的两性霉素B。