[发明专利]脐带间充质干细胞的分离纯化方法

说明书

本发明涉及一种脐带间充质干细胞的分离纯化方法，属于干细胞与再生医学技术领域。该方法，包括以下步骤：分离脐带组织：取脐带组织，清洗去除血液，剪碎为组织碎片，备用；组织消化：取上述组织碎片，加入组织消化液震荡消化；所述组织消化液中含有中性蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶II和DNA酶；消化结束后加入终止液终止，过滤，得未消化的组织块和滤液，将滤液离心去除上清获得细胞；细胞培养：将上述组织块和细胞接种于培养瓶中，以无血清培养基进行培养，获得所述脐带间充质干细胞。上述脐带间充质干细胞的分离纯化方法，针对常规技术中酶消化法和组织块培养法的不足，能够在三至五天内得到足够的原代细胞。

技术领域

本发明涉及干细胞与再生医学技术领域，特别是涉及一种脐带间充质干细胞的分离纯化方法。

背景技术

间充质干细胞(MSC)是一类来源于中胚层的具有高度自我更新和多向分化能力的多能干细胞，可以在体外培养扩增并在特定条件下具有多向分化能力，可以分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、肝脏细胞，甚至还可以横向分化为神经细胞、表皮细胞等，MSC具有广阔的临床应用前景，是再生医学和组织工程领域中最重要的种子细胞。间充质干细胞最早被发现于骨髓组织中，随着研究的深入，在人体多种组织中也相继被发现，如骨髓、脂肪、脐带、胎盘等。

脐带组织属于胎盘组织，是包裹胎儿和羊水的一层半透明膜，胎儿出生后随胎盘一起排出母体，属于孕妇产后的废弃物。脐带组织中无血管、神经和淋巴管分布，具有一定的弹性，厚度在0.02-0.5mm之间，在电子显微镜下，脐带组织横截面由外到内可以分为5层：上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层，其中上皮层主要由脐带上皮细胞构成，脐带间充质干细胞存在于致密层等皮下层中。

脐带间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。脐带间充质干细胞(MSCs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨，软骨，肌肉，肌腱，韧带，神经，肝，内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。

然而，传统的人脐带间充质干细胞分离方法上存在效率低时间长的问题。原代脐带间充质干细胞的最常见分离方法包括酶消化法和组织块培养法。酶消化培养法的经济成本高，一般4～5h，一般使用胶原酶进行消化，但消化程度不易把控，如消化不够，无法得到足够数量的细胞，但消化时间过久，使用的酶对细胞的损伤又太大，细胞会大量死亡。且由于消化液为黏稠液体，离心时不易分离出细胞，因此酶消化法的效果不稳定。虽然，组织块培养法过程简便易行，且经济成本低，但原代培养时间太长，通常需要14～20d才能够得到数量不多的原代细胞。本发明主要通过改良消化酶的配方以及把酶消化法与组织培养法相结合，同时提高稳定性和细胞提取效率。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种脐带间充质干细胞的分离纯化方法，

一种脐带间充质干细胞的分离纯化方法，包括以下步骤：

分离脐带组织：取脐带组织，清洗去除血液，剪碎为组织碎片，备用；

组织消化：取上述组织碎片，加入组织消化液震荡消化；所述组织消化液中含有中性蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶II和DNA酶；消化结束后加入终止液终止，过滤，得未消化的组织块和滤液，将滤液离心去除上清获得细胞；

细胞培养：将上述组织块和细胞接种于培养瓶中，以无血清培养基进行培养，获得所述脐带间充质干细胞。

上述脐带间充质干细胞的分离纯化方法，针对常规技术中酶消化法和组织块培养法的不足，通过调整消化酶的配方，可分离大部分出脐带间充质干细胞，同时回收部分消化组织后的脐带组织与分离出的细胞一同培养，能够在三至五天内得到足够的原代细胞。