[发明专利]一种应用实时荧光RT-PCR定量检测罗湖病毒的方法

权利要求书

1.一种应用实时荧光RT-PCR定量检测罗湖病毒的方法，其特征在于：具体步骤如下：

S1、罗湖病毒的分离：

S1.1、可疑病例样品的处理方式：采集到的疑似样品需在配置一半以上体积冰袋、保温效果良好的保温箱中低温运输，温度保持在0-4℃；

S1.2、病毒的分离方法：在实验室无菌条件下获取疑似病例个体的肝、肾、脾、肠、腮和脑组织，用组织研磨机将样品匀浆成糊状，按照1：10的稀释度悬于适当的细胞培养液中，于30-37℃下孵育10-15min后放入离心机进行离心处理，离心后吸取包含细胞的上清液放入EP管中；

S2、样品中病毒RNA的提取：使用CTAB法或者商业试剂盒提取病毒RNA；

S3、RT-PCR检测方法的建立：

S3.1、根据Genbank中登记的罗湖病毒设计上下游引物；

S3.2、对提取取得的RNA进行逆转录，合成DNA后进行核酸扩增和鉴定；

S4、实时荧光定量PCR检测方法的建立：

S4.1、根据Genbank中登记的罗湖病毒基因NC_029930特异序列设计引物和探针；

S4.2、根据DNA序列，合成单链小片段DNA，再通过PCR方法，把单链小片段DNA拼接成一条完整的双链DNA片段，合成NC_029930(Tipapia)基因(465bp)，将合成的基因片段连接至pMD19-T载体中，构建阳性质粒；取In-Fusion产物转化至E.coli Competent Cell JM109保存备用；

对E.coli Competent Cell JM109菌落用M13-47/RV-M引物进行PCR，检测所含质粒中插入片段的长度大小；

对E.coli Competent Cell JM109菌落进行质粒DNA提取，测序，以验证阳性质粒序列；

S4.3、在无法取得罗湖病毒阳性样本的情况下，阳性质粒可以作为检测实验的阳性对照使用；

S4.4、利用阳性质粒为模板、设计的引物和探针进行扩增，验证引物、探针、模板的正确性；

S4.5、对扩增产物进行基因测序，录入Genbank进行比对，确认为罗湖病毒特异性序列；

S4.6、经实验确认，引物、探针设计；阳性对照构建，均有效。该项检测方法可对罗湖病毒进行分子生物学鉴定；

S5、建立形态解剖学特征鉴定感病个体的方法：通过上述方法最终建立形态解剖学和分子生物学方法结合的罗湖病毒检疫鉴定方法。

2.根据权利要求1所述的一种应用实时荧光RT-PCR定量检测罗湖病毒的方法，其特征在于：在步骤S1.2中可依据细胞培养结果考虑是否需要加入抗生素以防治污染，提高细胞成活率。

3.根据权利要求1所述的一种应用实时荧光RT-PCR定量检测罗湖病毒的方法，其特征在于：在步骤S1.2中离心温度为0-4℃，离心机转速为8000-12000r/min，离心时间为10-15min。

4.根据权利要求1所述的一种应用实时荧光RT-PCR定量检测罗湖病毒的方法，其特征在于：在步骤S3中使用双标记荧光探针法，在步骤S3.1中设计的引物分别为：上游引物：TiLV-PFSeq：5'TCACCCCACTCTATATTATC3'，下游引物：TiLV-PRSeq：5'AGTCGGAAGATCAAGAAG3'，在步骤S4.1中设计的引物、探针：上游引物：TiLV-PFSeq：5'TCACCCCACTCTATATTATC3'，下游引物：TiLV-PRSeq：5'AGTCGGAAGATCAAGAAG3'，探针：(FAM)CCGCTCTCGTCAGCACCATA(TAMRA)。

5.根据权利要求1所述的一种应用实时荧光RT-PCR定量检测罗湖病毒的方法，其特征在于：在步骤S3.2中也可以采用一步法，在一个反应体系内完成逆转录和扩增，根据设备及逆转录酶的特性，设计反应条件并进行优化。