[发明专利]一种应用实时荧光RT-PCR定量检测罗湖病毒的方法

说明书

本发明公开了一种应用实时荧光RT‑PCR定量检测罗湖病毒的方法，具体涉及罗湖病毒检测技术领域，具体步骤如下：S1、罗湖病毒的分离；S2、样品中病毒RNA的提取；S3、RT‑PCR检测方法的建立；S4、实时荧光定量PCR检测方法的建立；S5、建立形态解剖学特征鉴定感病个体的方法。本发明通过建立该病毒分子生物学检验鉴定方法，可为水产养殖加工和贸易企业提供此类病毒检测服务并出具检验报告，同时可为政府监管部门开展疫情监测和防治提供技术服务，并且参与官方及水产企业的防疫防控工作并提供技术支持和疫情确认，另外待检测方法建立后，可以与水产养殖企业和防治药剂生产企业合作，研制罗湖病毒预防和治疗的药剂，具有广阔的发展前景。

技术领域

本发明涉及罗湖病毒检测技术领域，更具体地说，本发明涉及一种应用实时荧光RT-PCR定量检测罗湖病毒的方法。

背景技术

罗非鱼是一种非常重要的食用鱼类，世界第二大水产养殖品种。2015年世界罗非鱼养殖和捕捞产量达到640万吨，价值约98亿美元，全球贸易额达18亿美元，2016年和2017年产量持续增长，作为一种重要的动物性蛋白来源，罗非鱼具有分布范围广、适应能力强、生长周期短、食性广泛、抗病性强等优点，被认为是全球粮食安全和营养的“支柱”之一，为包括许多小农在内的千百万人提供粮食、就业及国内和出口收入。

近期，联合国粮农组织发布罗非鱼罗湖病毒(TiLV)特别警报，在全球六个国家发生罗湖病毒疫情，殃及南美、亚洲和中东地区，目前，尚不确定罗湖病毒是否会通过冷冻罗非鱼产品进行传播，但粮农组织指出，罗湖病毒有可能比目前已知的分布范围更广，给全球罗非鱼养殖造成严重威胁，罗湖病毒在24-33℃均可以生长，最适温度25℃，所以每年的5-10月份均可能导致发病，粮农组织(FAO)指出，罗非鱼生产国需要保持警惕，在开展罗非鱼贸易时应遵守世界动物卫生组织《水生动物卫生法典》，这些国家应该实施主动监测计划，以确定是否存在罗湖病毒，其感染的地理范围，并确定有助于遏制传播的风险因素，佛罗里达大学养殖学专家CraigWatson表示，世界动物卫生组织(OIE)将罗湖病毒列为“须报告病毒”的可能性非常大。一旦实施，水产进口国将对易感染的品种展开进口检验，如活鱼。另据阳江本市多家罗非鱼出口厂家反馈，目前出口非洲科特迪瓦等国家的罗非鱼要求出具中国官方检疫合格证书。

鉴于罗非鱼在我国及全球巨大的经济意义，以及罗湖病毒严重的危害性，世界多国已经将其列为产品入境的检疫项目，但目前在公开发表的文献中尚无罗湖病毒检疫鉴定方法，也尚未有有效的治疗方法，根据目前的研究现状，对于罗湖病毒的系统性研究尚不够深入，相关免疫学、分子生物学检测方法尚未正式建立，鉴于该病毒的传播性及危害性较大，有必要开展其流行传播情况的调查研究，并需快速筛查及准确鉴定方法的技术支持，故需要一种应用实时荧光RT-PCR定量检测罗湖病毒的方法。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供一种应用实时荧光RT-PCR定量检测罗湖病毒的方法，通过建立该病毒分子生物学检验鉴定方法，可为水产养殖加工和贸易企业提供此类病毒检测服务并出具检验报告，同时可为政府监管部门开展疫情监测和防治提供技术服务，并且参与官方及水产企业的防疫防控工作并提供技术支持和疫情确认，另外待检测方法建立后，可以与水产养殖企业和防治药剂生产企业合作，研制罗湖病毒预防和治疗的药剂，具有广阔的发展前景。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种应用实时荧光RT-PCR定量检测罗湖病毒的方法，具体步骤如下：

S1、罗湖病毒的分离：

S1.1、可疑病例样品的处理方式：采集到的疑似样品需在配置一半以上体积冰袋、保温效果良好的保温箱中低温运输，温度保持在0-4℃；

S1.2、病毒的分离方法：在实验室无菌条件下获取疑似病例个体的肝、肾、脾、肠、腮和脑组织，用组织研磨机将样品匀浆成糊状，按照1：10的稀释度悬于适当的细胞培养液中，于30-37℃下孵育10-15min后放入离心机进行离心处理，离心后吸取包含细胞的上清液放入EP管中；