[发明专利]西伯利亚鲟全长脂联素蛋白基因原核表达的方法及应用

说明书

本发明公开了一种西伯利亚鲟全长脂联素蛋白基因原核表达的方法及应用，包括：(1)脂联素成熟肽的克隆；(2)重组质粒的构建；(3)重组质粒诱导表达。本发明的方法使西伯利亚鲟脂联素蛋白能够在原核生物内实现大批量、低成本生产，最后可用于功能验证等注射试验及添加剂。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种西伯利亚鲟全长脂联素蛋白基因原核表达的方法及应用。

背景技术

西伯利亚鲟(Acipenser baerii Brandt)属鲟科(Acipenserdae)鲟属(Acipenser)，具有食谱广、易驯养、生长快，鱼子酱质量高等特点，已被推广到世界许多国家和地区养殖。同时，中国是最大的鲟鱼鱼子酱生产国和出口国。可以看出西伯利亚鲟具有较高的经济价值。但西伯利亚鲟养殖周期长，对饲料营养全面性及均衡性要求高。在漫长的养殖过程中容易发生各种代谢相关的慢性疾病，如脂肪肝。因脂肪积累而产生的脂肪肝将会影响鲟鱼的生长和发育，导致鱼子酱的产量和质量下降，影响经济效益。

脂联素(Adiponectin,AdipoQ)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性蛋白质，主要在脂肪降解和葡萄糖水平调节中发挥作用，也在抗炎和动脉粥样、促血管形成因子和抗血管形成因子中发挥作用。因此，若能将脂联素蛋白应用到西伯利亚鲟的养殖中，可减少该鱼在养殖中发生代谢性疾病的可能性，从而提升养殖效率和经济效益。因此，脂联素蛋白具有广泛的应用前景。

西伯利亚鲟脂联素蛋白包括全长脂联素(full-length adiponectin，fAd)。该种形式蛋白被广泛应用于脂联素蛋白的功能验证试验。全长脂联素的合成主要依靠人工合成，成本较高，产量较低，仅可用于试验，而无法满足实际养殖生产过程中的需求。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有技术中人工合成全长脂联素，成本高，产量低，无法满足实际养殖生产过程中的需求的问题，提供一种西伯利亚鲟全长脂联素蛋白基因原核表达的方法及应用。

本发明采用的技术方案如下：

一种西伯利亚鲟全长脂联素蛋白基因原核表达的方法，包括：

(1)成熟肽基因的克隆：根据全长脂联素蛋白的氨基酸序列，设计分别带有BamHI酶切位点和HindⅢ酶切位点的上下游引物，进行PCR扩增，得到目的核苷酸片段；

(2)重组质粒的构建：将原核表达载体与目的核苷酸片段进行重组，构成能表达出氨基酸序列的重组质粒；

(3)重组质粒诱导表达：将重组质粒导入表达菌株中，并利用诱导剂诱导重组质粒在表达菌株中表达。

进一步地，(3)中表达菌株为E.coli BL21，诱导剂为异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷。

进一步地，将重组质粒转化到表达菌株E.coli BL21中，在37℃，200rpm/min条件下于含氨苄霉素的液体LB培养基中培养至OD₆₀₀值达0.4～0.6，再添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导培养，使重组质粒在表达菌株中表达。

进一步地，诱导培养的条件为：温度为37℃，诱导剂浓度为1.0-1.2mmol/L，诱导时间为6-8h。

上述的方法在蛋白功能试验或制备添加剂中的应用。

用于上述的方法中的上下游引物，具体为：

上游引物：5'-GCGGATCCCAGGAGGAGGGTGAA-3'；

下游引物：5'-GGAAGCTTGCGATCTCCGTTTACTGT-3'。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：