[发明专利]一种以脂肪酸为原料利用大肠杆菌工程菌制备α，β不饱和脂肪酸的方法

权利要求书

1.一种利用大肠杆菌工程菌制备α，β不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，步骤如下：

发酵培养大肠杆菌工程菌，诱导表达后收集菌体，超声破碎菌体细胞，向破碎菌液中加入癸酸，35～40℃条件下利用无细胞体系生产反式-2-癸烯酸；

所述大肠杆菌工程菌的构建方法，步骤如下：

(1)构建重组质粒petDuet-FadE、重组质粒pet28a-sumo-YdiI；

所述酯酰辅酶脱氢酶FadE基因核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；酯酰CoA硫酯酶基因YdiI的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

（2）利用步骤（1）制得的重组质粒petDuet-FadE,构建petDuet-FadE-FadD质粒；

脂酰CoA合成酶基因FadD的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；

（3）利用RED重组法敲除FadR和FadB基因，构建基因缺失菌株∆FadRB；

（4）取步骤（1）、（2）制得的重组质粒pet28a-sumo-YdiI和petDuet-FadE-FadD质粒共转化到基因缺失菌株∆FadRB，制得重组菌YED-∆FadRB。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，构建重组质粒petDuet-FadE，包括如下步骤：

以大肠杆菌BL21基因组为模板，扩增酯酰辅酶脱氢酶FadE基因,上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，然后将petDuet质粒用HindIII进行酶切、纯化，再与酯酰辅酶脱氢酶FadE的基因进行无缝克隆，制得重组质粒petDuet-FadE；

PCR扩增体系如下，总体系50μL：

100μM上游引物2.0μL，100μM下游引物2.0μL，模板2.0μL，5U/μL phanta酶25μL，ddH₂O19μL；

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min15s，循环30次；72℃延伸5min。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，构建重组质粒pet28a-sumo-YdiI，包括如下步骤：

以大肠杆菌DH5a基因组为模板，扩增酯酰CoA硫酯酶基因Y diI, 上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，然后将pet28a-sumo质粒和酯酰CoA硫酯酶基因Y diI分别用BamH I和Xho I分别进行双酶切，经连接酶连接，制得重组质粒pet28a-sumo-YdiI；

PCR扩增体系如下，总体系50μL：

100μM上游引物2.0μL，100μM下游引物2.0μL，模板2.0μL，5U/μL phanta酶25μL，ddH₂O19μL；

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min15s，循环30次；72℃延伸5min。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述连接酶连接条件为22℃连接10min。