[发明专利]一种以脂肪酸为原料利用大肠杆菌工程菌制备α，β不饱和脂肪酸的方法

说明书

本发明涉及一种利用大肠杆菌工程菌制备α，β不饱和脂肪酸的方法，该方法通过过表达该路径上的FadE、FadD和ydii基因，同时敲除FadR和FadB基因，阻断了β氧化的影响和细胞调控子的调控，优化反‑2‑癸烯酸表达途径，获得了大肠杆菌工程菌，并利用该工程菌通过优化转化过程中的相关条件，显著提高反‑2‑癸烯酸的转化率，可进一步用于10‑羟基‑2‑癸烯酸的生产。

技术领域

本发明涉及一种利用大肠杆菌工程菌制备α，β不饱和脂肪酸的方法，属于生物发酵技术领域。

背景技术

α，β不饱和脂肪酸(α，β-unsaturated fatty acids)是一种在α，β位的碳上具有不饱和双键的不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸(如油酸、亚油酸、芥酸等)主要用于制取矿石浮选剂、油田化学品和生产涂料用的二聚酸、三聚酸。

以反式2-癸烯酸为例，反式二癸烯酸是蜂王浆成分中的一种化合物，被用作合成10HDA、食品用合成香料(反式-2-癸烯酸乙酯)和药物中间体(反式-2-癸烯酸衍生物)

目前α，β不饱和脂肪酸的获得方法主要为化学合成法。其合成方法主要为建设或利用α、β-unsaturated羰基化合物进行开发，通过醛缩合、wittig型反应或者对羰基化合物进行脱氢从而构建官能团。

α，β不饱和脂肪酸作为反应中间体，难获得且制备复杂，从而造成产量小，无法满足市场需求的现状，目前，市面上尚无大规模生产反式二癸烯酸的生产，价格昂贵约为3万/kg。

因而探索α，β不饱和脂肪酸高效方便、低成本的合成方法，对其大规模开发和利用具有重要的理论和应用价值。利用生物催化合成设计细胞内的反应序列，将三个关键酶识别和结合表达在级联序列在三个步骤上提高关键酶的表达成熟度，进一步敲除两个阻碍级联反应的基因，阻断副反应的发生，从而达到不依赖于自然发生的途径，由脂肪酸是利用酶的混合物产生α,β-UCAs。

利用廉价的原料如癸酸发酵生产α，β不饱和脂肪酸的相关技术未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种以脂肪酸为原料利用大肠杆菌工程菌生产制备α，β不饱和脂肪酸的方法。

本发明的技术方案如下：

一种以脂肪酸为原料利用大肠杆菌工程菌静息细胞制α，β不饱和脂肪酸的方法，步骤如下：

(1)构建重组质粒petDuet-FadE、重组质粒pet28a-sumo-YdiI；

所述酯酰辅酶脱氢酶FadE的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；酯酰CoA硫酯酶基因ydiI的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

(2)利用步骤(1)制得的重组质粒petDuet-FadE,构建petDuet-FadE-FadD质粒；

脂酰CoA合成酶基因FadD的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；

(3)利用RED重组法敲除基因，构建基因缺失ΔFadRB菌株(以下将同时敲除FadR和FadB的工程菌缩写为ΔFadRB)；

(4)取步骤(1)(2)制得的重组质粒pet28a-sumo-YdiI和petDuet-FadE-FadD质粒(以下将pet28a-sumo-YdiI和petDuet-FadE-FadD两个质粒缩写为YED)共转化到基因缺失ΔFadRB的菌株，制得重组菌YED-ΔFadRB的菌株。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，构建重组质粒petDuet-FadE，包括如下步骤：