[发明专利]一株高产L-缬氨酸的基因工程菌及发酵生产L-缬氨酸方法

权利要求书

1.一种高产L-缬氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌从大肠杆菌W3110出发，在其基因组上整合了枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合酶基因alsS并使其强表达；并在其基因组上整合了大肠杆菌ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体R290E/K292D基因spoT并使其强表达；并敲除其基因组上乳酸脱氢酶基因ldhA、丙酮酸甲酸裂解酶I基因pflB和富马酸还原酶四个亚基的基因frdA、frdB、frdC、frdD；并将大肠杆菌的支链氨基酸转氨酶基因ilvE替换为枯草芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因bcd；并将大肠杆菌的乙酰羟酸异构还原酶基因ilvC替换为具有L67E/R68F/K75E突变的乙酰羟酸异构还原酶突变体基因，构建基因工程菌。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述乙酰乳酸合酶编码基因alsS整合在假基因ydeU位点，并由启动子P_trc启动；所述ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体R290E/K292D的编码基因spoT整合在假基因yeeP位点，并由启动子P_trc启动。

3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体R290E/K292D基因spoT的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述乙酰羟酸异构还原酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

5.权利要求1-4任一项所述基因工程菌用于发酵生产L-缬氨酸的用途。

6.一种利用权利要求1-4任一项所述基因工程菌发酵生产L-缬氨酸的方法，其特征在于，采用双阶段溶氧控制方式，先进行好氧发酵，至发酵中后期转为厌氧发酵。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将菌种活化后制备种子液，按10-15%接种量接种到装有发酵培养基的三角瓶中，37℃，200 r/min振荡培养；12-16 h后，将菌液转移到30 mL的封口瓶中，隔绝空气，37℃，200 r/min振荡培养8-12 h；

所述发酵培养基组成为：葡萄糖 18 g/L，酵母粉 1 g/L，蛋白胨 2 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L，柠檬酸钠 1 g/L，MgSO₄•7H₂O 0.7 g/L，FeSO₄•7H₂O 100 mg/L，MnSO₄•H₂O 100 mg/L，V_B1 0.8mg/L，V_H 0.3 mg/L，苯酚红20 mL/L，消泡剂两滴，初始pH 7.0-7.2。