[发明专利]一株高产L-缬氨酸的基因工程菌及发酵生产L-缬氨酸方法

说明书

本发明提供了一株高产L‑缬氨酸的基因工程菌，从大肠杆菌W3110出发，在其基因组上整合了枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合酶基因alsS并使其强表达；并在其基因组上整合了大肠杆菌ppGpp 3′‑焦磷酸水解酶突变体R290E/K292D基因spoT并使其强表达；并敲除其基因组上乳酸脱氢酶基因ldhA、丙酮酸甲酸裂解酶I基因pflB和富马酸还原酶四个亚基的基因frdA、frdB、frdC、frdD；并将大肠杆菌的支链氨基酸转氨酶基因ilvE替换为枯草芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因bcd；并将大肠杆菌的乙酰羟酸异构还原酶基因ilvC替换为突变体L67E/R68F/K75E的编码基因。本发明还改进了L‑缬氨酸发酵方法，采用双阶段溶氧控制，提高了L‑缬氨酸产率和糖酸转化率。

技术领域

本发明涉及微生物领域、基因工程领域和发酵工程领域，具体涉及一株高产L-缬氨酸的基因工程菌及其应用。

背景技术

L-缬氨酸(L-valine)是一种支链氨基酸(Branched chain amino acids,BCAA)，广泛应用于食品、医药、化妆品以及饲料等领域。作为人体的必需氨基酸，它不仅可以促进肌肉形成、强化肝功能、减轻肌肉疲劳，还可以作为免疫抗生素药物合成的中间体，而且还能促进皮肤胶质蛋白合成。近些年，作为一种重要的饲料日粮氨基酸品种，L-缬氨酸需求量持续增加。

L-缬氨酸的合成支路以丙酮酸为直接前体物。丙酮酸经过乙酰羟酸合成酶AHAS、乙酰羟酸异构还原酶AHAIR、二羟酸脱水酶DHAD和支链氨基酸转氨酶TAs催化的四步反应最终生成L-缬氨酸。L-缬氨酸菌株改造主要集中在几个方面：(1)解除终产物对合成限速酶的反馈抑制。由关键前体物丙酮酸合成L-缬氨酸的关键酶是乙酰羟酸合成酶AHAS，AHAS受3种分支链氨基酸，包括L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸的反馈抑制。(2)增强还原力NADPH供应。乙酰羟酸异构还原酶AHAIR和支链氨基酸转氨酶TAs催化的反应是以辅酶NADPH为辅酶，因此增强菌株的还原力NADPH供应可提高L-缬氨酸合成效率。(3)增强产物输出。L-缬氨酸输出需要细胞膜上的特异转运蛋白，增加转运蛋白的表达有助于L-缬氨酸积累。

目前L-缬氨酸的生产菌株多为谷氨酸棒杆菌。谷氨酸棒杆菌的基因工程改造较为复杂、周期较长，菌株改进难度大。另外，谷氨酸棒杆菌工业菌株通过质粒过表达关键酶基因来增加L-缬氨酸的代谢通量，但是质粒稳定性低，并且对菌体生长有一定影响，导致发酵周期延长，不利于工业化生产L-缬氨酸。

大肠杆菌是另一种常用的氨基酸生产菌，大肠杆菌具有遗传背景清晰，操作简便等优点。2007年，ParkJH等在大肠杆菌W3110中引入了突变的AHASIII，解除了L-缬氨酸的反馈抑制。随后，过表达了全局调控因子Lrp和转运蛋白YgaZH，构建的菌株可以产生L-缬氨酸7.61g/L。2011年，Park JH等在大肠杆菌亚株W中过表达基因ilvBN^mut、ilvCDE、ygaZH和lrp，L-缬氨酸产率达到60.7g/L。谢希贤等整合枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶的编码基因alsS，解除了L-缬氨酸对合成通路的反馈抑制；同时整合大肠杆菌ppGpp 3′-焦磷酸水解酶的突变基因spoT^M，增强了丙酮酸供应，获得的工业菌株VHY03经24h摇瓶发酵生产L-缬氨酸36g/L。上述菌株均采用好氧发酵，呼吸旺盛，过多的丙酮酸通过三羧酸循环代谢变成CO₂，造成糖酸转化率偏低，L-缬氨酸生产成本偏高。

发明内容

本发明目的之一是提供一种L-缬氨酸工程菌构建的新思路，解决了L-缬氨酸的合成代谢中辅酶供需不平衡和糖酸转化率偏低的问题，通过定向改造获得了一株高产L-缬氨酸的大肠杆菌基因工程菌。

本发明目的之二是利用大肠杆菌基因工程菌发酵生产L-缬氨酸，并改进了L-缬氨酸发酵控制工艺，采用双阶段溶氧控制，提高了L-缬氨酸产率和糖酸转化率。

本发明为了实现上述目的而采取的技术方案概述如下：