[发明专利]一种利培酮人工抗原及其制备方法

权利要求书

1.一种利培酮半抗原，其特征在于，其具有如式(Ⅰ)所示的结构：

2.一种利培酮人工抗原，其特征在于，其具有如式(Ⅱ)所示的结构：其中，p为载体蛋白，n表示一个载体蛋白上偶联的利培酮半抗原的个数；

3.根据权利要求2所述的一种利培酮人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、牛γ球蛋白、牛甲状腺球蛋白、钥孔血蓝蛋白和鸡卵清白蛋白中的任意一种。

4.一种制备利培酮半抗原的方法，其特征在于，该方法用于制备权利要求1所述的半抗原，包括如下步骤：

(a)在第一反应容器中，加入利培酮，加入氢化铝锂和无水THF，氮气保护下，68℃回流反应2-24小时；停止反应，冷却后，加入氢氧化钠溶液，调pH＝8，过滤，旋干，得到油状物；经薄层色谱法纯化得到产物；其中，利培酮：氢化铝锂＝1:1～1:4，此比例为物质的量之比；

(b)称取步骤(a)所得产物于第二反应容器中，加入DMF，再加入溴乙酸乙酯，碳酸钾，搅拌溶解，反应温度提高至100℃反应2-24小时；反应结束后冷却，进行减压蒸馏得到粗产物，薄层层析法纯化得到产物；其中，步骤(a)所得产物：溴乙酸乙酯：碳酸钾＝1:1:1～1:4:4，此比例为物质的量之比；

(c)将步骤(b)所得产物溶于无水乙醇中，加入水，再加入质量分数为10％碳酸钾溶液；室温下搅拌反应1-24小时；调pH＝2～6，然后用乙酸乙酯萃取，减压蒸馏得到利培酮半抗原；步骤(b)所得产物：无水乙醇：水：质量分数为10％碳酸钾溶液＝100mg:(2-20)ml:(2-20)ml:(1-40)ml。

5.一种制备利培酮人工抗原的方法，其特征在于，该方法用于制备权利要求2-3任一项所述的利培酮人工抗原，包括如下步骤：

(1)利培酮半抗原的制备

(a)在第一反应容器中，加入利培酮，加入氢化铝锂和无水THF，氮气保护下，68℃回流反应2-24小时；停止反应，冷却后，加入氢氧化钠溶液，调pH＝8，过滤，旋干，得到油状物；经薄层色谱法纯化得到产物；其中，利培酮：氢化铝锂＝1:1～1:4，此比例为物质的量之比；

(b)称取步骤(a)所得产物于第二反应容器中，加入DMF，再加入溴乙酸乙酯，碳酸钾，搅拌溶解，反应温度提高至100℃反应2-24小时；反应结束后冷却，进行减压蒸馏得到粗产物，薄层层析法纯化得到产物；其中，步骤(a)所得产物：溴乙酸乙酯：碳酸钾＝1:1:1～1:4:4，此比例为物质的量之比；

(c)将步骤(b)所得产物溶于无水乙醇中，加入水，再加入质量分数为10％碳酸钾溶液；室温下搅拌反应1-24小时；调pH＝2～6，然后用乙酸乙酯萃取，减压蒸馏得到利培酮半抗原；步骤(b)所得产物：无水乙醇：水：质量分数为10％碳酸钾溶液＝100mg:(2-20)ml:(2-20)ml:(1-40)ml；

(2)利培酮人工抗原的制备：

a.称取利培酮半抗原于第三反应容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺，再加入N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二环己基碳二亚胺，室温搅拌反应过夜，反应结束后离心，取上清液记为A液；其中，利培酮半抗原：N-羟基琥珀酰亚胺：N,N-二环己基碳二亚胺＝1:1:1～1:4:4,此比例为物质的量之比；

b.制备pH为7.2～7.4的PBS缓冲液；

c.称取载体蛋白溶于步骤b所述的pH为7.2～7.4的PBS缓冲液中，得到的溶液记为B液；B液中，载体蛋白浓度为2-20mg/ml；

d.在搅拌下，将A液缓慢滴加到B液，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到利培酮人工抗原混合液；A液：B液＝(1～5000):1000，此比例为体积之比；

e.将利培酮人工抗原混合液移入透析袋中，用步骤b中得到的pH为7.2～7.4的PBS缓冲液透析，透析结束后，离心取上清液即得到利培酮人工抗原。

6.根据权利要求5所述的一种制备利培酮人工抗原的方法，其特征在于，

所述pH为7.2～7.4的PBS缓冲液的配制方法：称取14.5g十二水磷酸氢二钠，43.875g氯化钠，1.495g二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L。