[发明专利]循环肿瘤细胞阴性富集检测方法

权利要求书

1.一种循环肿瘤细胞阴性富集检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：向含有全血样本的第一离心管中加入红细胞特异性抗体和白细胞特异性抗体的组合，以使全血样本中红细胞和白细胞耦联在一起；

S2：利用密度梯度离心法去除所述全血样本中耦联在一起的红细胞和白细胞，以实现循环肿瘤细胞阴性富集。

2.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法，其特征在于，执行S2具体包括如下步骤：

将所述第一离心管放在摇床上孵育；

向带有插件的第二离心管中加入密度梯度离心液，将孵育好的所述第一离心管中的全血样本转入所述第二离心管中；

将所述第二离心管放置于离心机中进行离心，离心后全血样本中单核细胞层位于所述插件上方，含有耦联在一起的红细胞和白细胞位于所述插件下方；

将进行离心后位于所述第二离心管中插件上方的样本倒入第三离心管。

3.如权利要求2所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法，其特征在于，在执行S2之后，还包括如下步骤：

S3：利用细胞荧光抗体悬浮染色来标记CTCs，并基于扫描采集的荧光信号，通过细胞染色和形态来鉴定CTCs。

4.如权利要求3所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法，其特征在于，在S3中，所述细胞荧光抗体包括：抗人EpCAM的细胞表面上皮细胞黏附分子抗体、抗人CK的细胞角蛋白抗体、细胞核染料DAPI和抗人CD45的白细胞特异性抗体。

5.如权利要求4所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法，其特征在于，在S3中，通过荧光扫描仪进行荧光信号的采集，并根据细胞染色和形态鉴定CTCs。

6.如权利要求5所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法，其特征在于，将符合DAPI+且CK/EpCAM+且CD45-染色特征和细胞形态学特征的细胞定义为CTCs。

7.如权利要求3所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法，其特征在于，执行S3具体包括如下步骤：

向所述第三离心管中加入细胞稀释液，并依次进行混匀，离心；

将进行离心后的第三离心管中样本去上清后，加入细胞固定液进行固定、透化，然后加入细胞洗液，进行离心；

弃上清，向所述第三离心管中加入细胞核染料、细胞角蛋白、EpCAM、CD45避光孵育染色；

向所述第三离心管中再次补充细胞洗液，进行离心；

弃上清，将所述第三离心管中样本转移到96孔读数板中，进行扫描和图像分析。

8.如权利要求7所述的循环肿瘤细胞阴性富集检测方法，其特征在于，所述细胞核染料为DAPI。