[发明专利]一种中华绒螯蟹双顺反子病毒的RT-PCR检测方法

权利要求书

1.一种中华绒螯蟹双顺反子病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于：按以下步骤进行：

（1）取50-100mg待检组织，提取组织总RNA；

（2）待检样品的反转录管用19μL无RNase的双蒸水溶解，加1μL 提取的总RNA，42度保温60分钟，75度保温10分钟；

（3）待检样品PCR管加24μL双蒸水溶解后，加1μL合成的cDNA，混匀；

（4）阳性对照PCR管中，加25μL双蒸水溶解；

（5）将步聚（3）、（4）的PCR管进行PCR扩增，扩增条件为：93-95度预变性3分钟后，按94度变性30秒、50-57度退火30秒、72度延伸20-25秒，共扩增25-35个循环，最后72度延伸10分钟；

（6）PCR反应结束后，取8-10μL反应产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离，尔后在紫外观察仪下观察，如果待检样品和阳性对照均可观察到0.29kb的特异性条带，则可判别为待检样品中含有中华绒螯蟹双顺反子病毒，如果待检样品中没有观察到0.29kb的特异性条带，而阳性对照中可观察到0.29kb的特异性条带，则可判别为待检样品中无中华绒螯蟹双顺反子病毒。

2.根据权利要求1所述的一种中华绒螯蟹双顺反子病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于：述的待检样品的反转录管按以下方法制备：取5×反转录缓冲液4μL、4dNTPs Mix(每一种dNTP的终浓度为2.5mM) 4.0μL、RNA酶抑制剂（40U/μL） 0.5μL，250pmol/L引物1μL、禽成髓细胞瘤病毒反转录酶AMV (10U/μL) 1μL，在离心管中混匀后，冻干，保存于-20度，其中引物的序列如SEQ ID NO2，

SEQ ID NO2: GCTGCGCGAGTGCATCCCAC。

3.根据权利要求1所述的一种中华绒螯蟹双顺反子病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于：述的待检样品PCR管按以下方法制备：取10×PCR缓冲液2.5μL、4dNTPs Mix(每一种dNTP的终浓度为2.5mM) 2.5μL、250pmol/L引物对各1μL、MgCl2(25mM) 1.5μL、Taq DNA 聚合酶(5U/μL) 0.3μL混匀后，冻干，于-20度保存，其中的引物对序列如SEQ ID NO1和SEQ IDNO2，

SEQ ID NO1：

TGAGCAGGCGATCCAACTAC，

SEQ ID NO2:

GCTGCGCGAGTGCATCCCAC。

4.根据权利要求1所述的一种中华绒螯蟹双顺反子病毒的的RT-PCR检测方法，其特征在于：述的阳性对照PCR管按以下方法制备：取10×PCR缓冲液2.5μL、4dNTPs Mix(每一种dNTP的终浓度为2.5mM) 2.5μL、250pmol/L引物对各1μL、MgCl2(25mM) 1.5μL、Taq DNA 聚合酶(5U/μL) 0.3μL加入至含有10ng阳性质粒的PCR管中， 混匀后冻干，-20度保存；其中阳性质粒中含有中华绒螯蟹双顺反子病毒的特异性序列如SEQ ID NO3，SEQ ID NO3:

TGAGCAGGCGATCCAACTACGCGCCGATGTTGATGATGCCATAAGGCGATGTCGTGAGGATGAGCCCATTGAGGTCATCTGGATAGACACCCTTAAGGATGAGCGCCGATCCCACGAGAAGGTCGATGCTGGCAAGACTAGGATCATTTCTAATGGTCCCATGCACATCAACATTGCCTTCCGCATGTATTTCATGGCCGCGCTGGCGCATCTGCGTGCTGGTCGCATATACAACGGAATTGCTGTGGGCATCAACGTGTGGAGTCGCGAGTGGGATGCACTCGCGCAGC。

5.根据权利要求1所述的一种中华绒螯蟹双顺反子病毒的的RT-PCR检测方法，其特征在于：所述待检组织为血淋巴、肌肉或肝胰腺，所述组织总RNA的提取按常规的Trizol方法进行。