[发明专利]一种中华绒螯蟹双顺反子病毒的RT-PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种中华绒螯蟹双顺反子病毒的RT‑PCR检测方法，按以下步骤进行：（1）取50‑100mg待检组织，提取组织总RNA；（2）待检样品的反转录管用19μL无RNase的双蒸水溶解，加1μL提取的总RNA，42度保温60分钟，75度保温10分钟；（3）待检样品PCR管加24μL双蒸水溶解后，加1μL合成的cDNA，混匀；（4）阳性对照PCR管中，加25μL双蒸水溶解；（5）将步聚（3）、（4）的PCR管进行PCR扩增，扩增条件为：93‑95度预变性3分钟后，按94度变性30秒、50‑57度退火30秒、72度延伸20‑25秒，共扩增25‑35个循环，最后72度延伸10分钟。

技术领域

本发明涉及一种检测病毒的检测方法，具体涉及中华绒螯蟹双顺反子病毒的RT-PCR检测方法。

背景技术

双顺反子病毒（Dicistrovirus）在分类上属于双顺反子病毒(Dicistroviridae)的成员，双顺反子病毒科由Cripavirus 和 Aparavirus二个属构成。病毒粒子大致呈球形，直径约30nm，无囊膜。病毒核酸为正义单链RNA，分子量在8500-10000nt之间，病毒RNA基因组单价，有二个不重叠的开放读码框，双顺反子病毒科的所有成员感染无脊椎动物，大部分成员在自然界广泛存在。双顺反子病毒感染通常不导致显性疾病，但可导致预期寿命减少。

蟹是一种广泛养殖的水产品种。已有的研究指出一种青蟹双顺反子病毒-1 (mudcrab discistrovirus-1,MCDV-1)能引起拟穴青蟹(Scylla paramamosain)、 锯缘青蟹(Scylla serrata)的“嗜睡病”爆发，人工感染拟穴青蟹青蟹的死亡率可达100%。分子流行病学调查结果显示，运用双重巢式PCR方法可在拟穴青蟹中广泛检测到青蟹双顺反子病毒-1 (mud crab discistrovirus-1,MCDV-1)，MCDV-1 在青蟹不同组织内的病毒量为: 血淋巴>鳃>肌肉>肝胰腺>心脏。在获得35株MCDV-1序列中,各个地区内获得的核酸序列同源性均在91.4%—100%之间，说明MCDV-1序列遗传进化出现一定的地域差异。

有研究报道显示，在源自马来西亚的罗氏沼虾中获得一种新的接近完整基因组序列的双顺反子病毒(strain MY13,KY607723),将其称为Macrobrachium rosenbergiidicistrovirus-2(MRDV-2),其基因组序列与患罗氏沼虾幼体死亡综合征的幼体中发现的另一种双顺反子病毒(Macrobrachium rosenbergii Taihu virus)不同。

中华绒螯蟹是我国养殖主要蟹种之一，但至今没有在中华绒螯蟹中发现双顺反子病毒的报道。

目前，已经建立了RT-PCR、双重巢式PCR、等温环介导扩增（LAMP）、实时荧光定量PCR以及原位杂交检测青蟹双顺反子病毒的技术；建立了用多抗－单抗双抗体夹心ELISA、双单抗夹心ELISA方法检测锯缘青蟹双顺反子病毒；建立了双重RT-PCR、ELISA、LAMP检测罗氏沼虾双顺反子病毒。然而这些检测均不涉及中华绒螯蟹双顺反子病毒。

有关中华绒螯蟹病毒性疾病的研究非常有限，养殖生产上经常发生一些不明病因或病原的疾病，例近年来常发的中华绒螯蟹肝胰腺坏死征。因此分离鉴定中华绒螯蟹组织中的病毒并对相关病毒进行检测，明确其可能的危害有重要意义。已有的研究显示双顺反子病毒对青蟹、罗氏沼虾危害严重，但双顺反子病毒是否对中华绒螯蟹养殖造成危害至今不明，因此研发中华绒螯蟹双顺反子病毒检测技术，并用于分子流行病调查对明确双顺反子病毒对中华绒螯蟹的危害有重要意义。

发明内容

本发明目的是提供一种中华绒螯蟹双顺反子病毒的RT-PCR检测方法，为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种中华绒螯蟹双顺反子病毒的RT-PCR检测方法，按以下步骤进行：