[发明专利]一种高浓度蒎烯耐受性产蒎烯工程菌的构建方法

说明书

本发明公开了一种高浓度蒎烯耐受性产蒎烯工程菌的构建方法，属于微生物技术领域。本发明选取耐高渗透压的产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018转化葡萄糖发酵生产蒎烯。该酵母对蒎烯耐受性可达1g/L，有效克服了蒎烯对宿主生产菌的生长抑制，蒎烯的产量达到0.8mg/L。本发明的制备方法具有操作方便、转化效率高、生产成本低、工业化应用前景广等特点。

技术领域

本发明提供了一种高浓度蒎烯耐受性产蒎烯工程菌的构建方法，属于微生物技术领域。

背景技术

蒎烯(pinene)，分子式C10H16，是一种重要的单萜类天然化合物，有α-和β-蒎烯两种异构体，二者均存在于多种天然精油中，以蒎烯为初始原料合成香料已成为工业合成香料的一个重要组成部分。蒎烯具有特殊的分子结构,是一种供电子体,其可与受电子体等进行自由基交替共聚,形成电荷转移络合物,从而合成性能优异的聚合物,扩大了其聚合物的应用范围。松节油中含有58～65％的α-蒎烯和30％的β-蒎烯，其二聚体具有与战术燃料JP-10相当的高体积能量，可作为现有喷气机燃料(如战术燃料JP-10和降冰片二烯二聚体的混合物RJ-5)的替代燃料。除此之外,蒎烯单体还具抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗抑郁和镇痛等功效，可作为多种药物的主要药理活性物,例如人们常用的治疗支气管炎的桉柠蒎肠溶胶囊。

目前蒎烯主要通过化学法合成，即采用高效精馏塔从脂松节油或粗硫酸盐松节油中进行分离提取。这种方法对设备要求较高，分离提取难度大、成本高，同时造成了大量自然资源的破坏。随着代谢工程和合成生物学的迅速发展，绿色可持续发展的微生物合成技术为先进生物燃料的制造提供了替代策略，即可利用大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等遗传背景清晰、基因操作体系成熟的模式微生物实现目标产品的高效合成。与大肠杆菌相比，酿酒酵母由于拥有更强大的蛋白表达和翻译后修饰系统以及完整的内膜系统，更适于蒎烯合成代谢过程中关键酶细胞色素P450蛋白的表达。但是，现有研究表明，200mg/L蒎烯使得酿酒酵母生物量降低75％，其较差的蒎烯耐受性会严重影响蒎烯的发酵生产。

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018是我国拥有自主知识产权的一株具有优良发酵性能的工业菌株，能在55％葡萄糖或15％NaCl的高渗透压培养基上正常生长繁殖，具有耐高渗和高抗逆性的特点。

发明内容

针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供了一种以耐高渗透压的产甘油假丝酵母为生产菌株生产蒎烯的方法，本发明所选耐高渗透压的产甘油假丝酵母菌株可利用20g/L的葡萄糖在1g/L蒎烯浓度下生成0.8mg/L的蒎烯。

本发明的第一个目的是提供一种高浓度蒎烯耐受性产蒎烯的工程菌。所述工程菌以产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018为宿主，将人工合成的来源于Pinus taeda的蒎烯合酶基因整合到宿主中，构建高浓度蒎烯耐受性产蒎烯工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述蒎烯合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述蒎烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种高浓度蒎烯耐受性产蒎烯工程菌的构建方法，所述方法是将SEQ ID NO.1整合到产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M93018基因组中。

在本发明的一种实施方式中，高浓度蒎烯耐受性产蒎烯工程菌的构建方法包括如下步骤：

(1)将SEQ ID NO.1采用BamHI和KpnI连接到pURGAPU质粒上构建重组表达载体，采用SacI线性化重组表达载体；