[发明专利]一种后睾科吸虫核糖体内转录间隔区的通用引物及设计和扩增方法

说明书

本发明涉及一种后睾科吸虫核糖体内转录间隔区的通用引物，所述正向引物序列为：ACAATGACGGTTTCAGCGAGT(SEQ ID No.1)，反向引物序列为：CACAAACAACCCGACTCCAAGG(SEQ ID No.2)。本发明还公开了该通用引物的设计和扩增方法以及用途。本发明的通用引物是基于核糖体内转录间隔区(ITS)两端保守的18S rDNA和28S rDNA序列设计，所得到的引物特异性极强，扩增的ITS1和ITS2进化速率相对较快，在种间存在显著的差异；将该引物用于后睾科吸虫华支睾吸虫和东方次睾吸虫的扩增，准确度高，克服了形态特征鉴定的缺陷，解决了种质混杂的问题。

技术领域

本发明属于动物分子生物学领域，涉及一种后睾科吸虫核糖体内转录间隔区的通用引物及设计和扩增方法。

背景技术

后睾科、异形科、Nanophyetidae和棘口科的吸虫是最重要的人畜共患寄生虫。在后睾科中，华支睾吸虫是最为重要的寄生虫。据报道，在我国华支睾吸虫的感染人口高达1290万人。除了能够感染人外，还可以寄生在犬、猫、猪等终末宿主。因此，华支睾吸虫病是一种非常重要的人畜共患寄生虫病。东方次睾吸虫与华支睾吸虫的生活史相似，虽然东方次睾吸虫主要感染禽类，但是人也有感染的报道。目前报道显示：在黑龙江流域的鱼类中，最主要的两种吸虫囊蚴是华支睾吸虫囊蚴和东方次睾吸虫囊蚴。而且这两种吸虫的囊蚴相似，这可能导致东方次睾吸虫病误诊为华支睾吸虫病。但是迄今关于东方次睾吸虫核糖体序列的报道极少，其中关于其核糖体内转录间隔区的研究更是空白。

近年来，由于PCR直接测序方法的建立以及广泛使用，研究学者越来越关注ITS的使用。ITS的进化速率相对其他各部分基因快，往往被用于低阶元间的进化分析，以及种属内、不同个体间的差异。对核糖体ITS的研究结果显示：ITS1、ITS2序列对于鉴定寄生虫的虫种是很有价值的遗传标记基因。通过对ITS序列进行分析发现，ITS1、ITS2序列变异位点相对较多，这些变异位点通常包含较多的信息。因此，如果能对寄生虫的ITS区段进行扩增，然后进行序列分析，对于寄生虫的种属鉴定将具有重要的意义。但是，现有技术中对于一次扩增，可以获取多个ITS区段的通用引物，研究尚少。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种后睾科吸虫核糖体内转录间隔区的通用引物，通过扩增可以获取多个ITS区段，方便对于ITS区段的变异点进行测序分析。

本发明的第二目的是提供上述后睾科吸虫核糖体内转录间隔区的通用引物的设计和扩增方法。

本发明的第三目的是提供上述后睾科吸虫核糖体内转录间隔区的通用引物的应用。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种后睾科吸虫核糖体内转录间隔区的通用引物，所述正向引物序列为：ACAATGACGGTTTCAGCGAGT(SEQ ID No.1)，反向引物序列为：CACAAACAACCCGACTCCAAGG(SEQID No.2)。

二、一种根据上述的后睾科吸虫核糖体内转录间隔区的通用引物的设计和扩增方法，该方法包括以下步骤：

(1)从Genbank获取后睾科吸虫28S rDNA和18S rDNA序列，利用Clusta1X vl.83做序列的比对，分别在3’端和5’端找出保守序列，作为引物候选区；

(2)利用OLIGO v6软件对候选区序列进行分析，设定引物序列选择条件。

进一步的，所述步骤(2)中引物序列选择条件为：引物长度21-24bp左右，GC含量40％-65％，退火温度为50-55℃。

三、上述的后睾科吸虫核糖体内转录间隔区的通用引物在鉴别一种后睾科吸虫中的应用。

进一步的，所述的鉴定过程为：提取待鉴别后睾科吸虫的基因组DNA，使用通用引物对提取的DNA进行核糖体内转录间隔区扩增反应，对扩增产物进行纯化测序。