[发明专利]一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法

权利要求书

1.一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，其特征在于，

拉曼采集多株含有革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的质控菌的单细胞拉曼图谱，将革兰氏阴性菌的数据放到一组，命名为Gram-negative，革兰氏阳性菌的数据放到另一组，命名为Gram-positive，

将这两组数据作为训练组，做主成分分析，然后基于主成分分析结果建立DFA分析模型，

然后采集待鉴定细菌的单细胞拉曼图谱，对原始图谱数据进行去背景、归一化处理，将数据输入DFA分析模型，对待鉴定细菌进行DFA分析鉴定其革兰氏阴阳性。

2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，其特征在于，选择8株细菌训练建库，其中包含4株革兰氏阴性菌，4株革兰氏阳性菌，光谱范围280～2187cm^-1，包含细胞指纹区600～1800cm^-1。

3.根据权利要求1或2所述的一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，其特征在于，训练组8株质控菌分别为：大肠埃希氏菌(ATCC-25922)、鲍曼不动杆菌(ATCC-19606)、肺炎克雷伯菌(ATCC-700603)、铜绿假单胞菌(ATCC-27853)、金黄葡萄球菌(ATCC-29213)、金黄葡萄球菌(ATCC-25923)、粪肠球菌(ATCC-29212)、表面葡萄球菌(ATCC-12228)。

4.根据权利要求1或2所述的一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，其特征在于，拉曼采集图谱前，对细菌进行以下处理：

将待测细菌从TSB平板转接到TSB液体培养基中，37℃，180rpm过夜培养，然后将菌液以1：1000的比例再转接一次到TSB液体培养基中，37℃，180rpm培养1h，取1ml菌液，7000rpm离心2min，去上清，加1ml无菌水洗涤沉淀，7000rpm离心2min，去上清，重复洗涤步骤1次，加0.5ml无菌水重悬，移取2μl点样到低拉曼背景芯片上进行拉曼检测，低背景拉曼芯片采用含有金属镀层的玻璃载玻片；低拉曼背景芯片购于上海氘峰医疗器械有限公司，Cat No1001，干燥后进行拉曼光谱采集。

5.根据权利要求1所述的一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，其特征在于，进行拉曼光谱采集的方法为：选用共聚焦拉曼光谱仪，532nm激光器，设置激光功率1～20mW，光谱仪光栅选择1200g/mm，在100x物镜下找到待测微生物单细胞，设定单谱采集时间1～20s，训练组每株细菌采集1000条光谱。

6.根据权利要求1所述的一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，其特征在于，建立DFA分析模型的方法为：

对原始图谱数据进行去背景、归一化处理，将革兰氏阴性菌的数据放到一组，命名为Gram-negative，革兰氏阳性菌的数据放到另一组，命名为Gram-positive；

使用R软件下基础包中prcomp函数，对两类数据进行PCA分析并利用第1、2主成分作图，然后利用R软件下的MASS包，基于PCA结果建立DFA分析模型并作图。

7.根据权利要求1或6所述的一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，其特征在于，原始图谱数据是仪器采集得到的每个细胞的拉曼图谱，

对原始图谱数据去背景、归一化处理后得到基线和信号强度一致的图谱，用于后续建模；归一化之后的数据包括波数和对应的强度。

8.根据权利要求1所述的一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，其特征在于，采集待鉴定细菌的单细胞拉曼图谱前，待鉴定细菌采用与训练组菌株相同的处理方法处理，对待鉴定细菌进行拉曼光谱采集的方法与对训练组菌株进行拉曼光谱采集的方法相同。

9.根据权利要求1所述的一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，其特征在于，采集已知菌种的待鉴定细菌的单细胞拉曼图谱时，每株细菌采集100条光谱，对原始图谱数据进行归一化处理，将数据输入建立好的DFA分析模型，对测试组数据进行DFA分析鉴定其革兰氏阴阳性。

10.根据权利要求9所述的一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，其特征在于，DFA分析模型里含有两组数据，革兰氏阴性菌的数据和革兰氏阳性菌的数据，测试数据已知革兰氏属性，当对测试数据进行测试时，模型会输出该测试数据分别被鉴定为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的百分比，当一株菌大于80％被鉴定为革兰氏阳性菌，说明该菌株为革兰氏阳性菌，当一株菌大于80％被鉴定为革兰氏阴性菌，说明该菌株为革兰氏阴性菌。