[发明专利]一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法

说明书

本发明涉及一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，拉曼采集多株革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌质控菌的单细胞拉曼图谱，将革兰氏阴性菌的数据放到一组，命名为Gram‑negative，革兰氏阳性菌的数据放到另一组，命名为Gram‑positive，将这两组数据作为训练组，做主成分分析，然后基于主成分分析结果建立DFA分析模型，然后采集待鉴定细菌的单细胞拉曼图谱，对原始图谱数据进行去背景、归一化处理，将数据输入DFA分析模型，对待鉴定细菌进行DFA分析鉴定其革兰氏阴阳性。与现有技术相比，本发明操作简单，节省时间，节省试剂及耗材。

技术领域

本发明涉及细菌的鉴定方法，尤其是涉及一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法。

背景技术

临床微生物学中革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的正确快速鉴定是进行药物敏感性分析进而治疗患者的第一步(O’Hara,C.M.,M.P.Weinstein,and J.M.Miller.Manualand automated systems for detection and identification ofmicroorganisms.Manual of clinical microbiology,8,185-207(2003))。临床可根据革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的致病物质不同及对不同抗生素的敏感性不同来参考用药。现有的临床病原菌革兰氏阴阳性鉴定方法主要是革兰氏染色法。通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。革兰氏染色法阳性反应和阴性反应是细菌鉴定和分离最重要最基本的方法，但缺点在于操作复杂耗时，需要经过三次染色和数次洗涤脱色步骤才能得到结果，且使用革兰氏染色时经常发现某些革兰氏阳性菌会褪色，某些革兰氏阴性菌会由于菌龄或培养基的不同而导致染色反应不准确。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法。

拉曼光谱可以反映化学键的能量，对化合物的结构进行判断。细菌的单细胞拉曼光谱，可以反应细菌胞内、细胞膜、细胞壁上的生物大分子及代谢物的成份和浓度，革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的细胞壁结构有显著性的差异，因此其拉曼图谱也分别具有相应的特点，于是构成了通过细菌拉曼图谱进行革兰氏阴阳性鉴定的基础前提。然而这种拉曼图谱的差异依靠肉眼很难观察到，因此本发明利用机器学习的方法对两类细菌的拉曼光谱进行训练，从而建立可以正确鉴定分类的算法模型。细菌分为两类：Gram-positive和Gram-negative，对训练组数据进行PCA分析，然后基于PCA结果建立DFA分析模型。最后用测试组数据进行验证。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种快速鉴定细菌革兰氏阴阳性的方法，拉曼采集多株含有革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的质控菌的单细胞拉曼图谱，将革兰氏阴性菌的数据放到一组，命名为Gram-negative，革兰氏阳性菌的数据放到另一组，命名为Gram-positive，将这两组数据作为训练组，做主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，然后基于主成分分析结果建立DFA(Discrimation Function Analysis)分析模型，然后采集待鉴定细菌的单细胞拉曼图谱，对原始图谱数据进行归一化(/面积)处理，将数据输入DFA分析模型，对待鉴定细菌进行DFA分析鉴定其革兰氏阴阳性。