[发明专利]大口黑鲈虹彩病毒的胶体金可视化检测方法及所用探针

说明书

本发明公开了一种大口黑鲈蛙病毒属虹彩病毒胶体金可视化检测方法及所用探针，该检测方法包括：将探针与胶体金混合孵育，得AuNPs‑probe；待测大口黑鲈中病毒DNA的提取；将病毒DNA与AuNPs‑probe混合后37℃培养，再添加NaCl溶液；2分钟后观察混合液的颜色变化；如混合液颜色仍为红色，则判定结果为阴性，如混合液颜色为灰蓝色，判定该样品结果为阳性。该方法简单、成本低、速度快、可靠，更适合现场检测。本发明为大口黑鲈虹彩病毒的快速检测提供了有效方法，为水产养殖提供技术保障。

技术领域

本发明涉及一种基于核酸探针的大口黑鲈蛙病毒属虹彩病毒胶体金可视化检测方法。

背景技术

加州鲈学名大口黑鲈(Micropterus salmoides)，原产于北美洲密西西比河流域，在分类学上隶属于鲈形目(Perciformes)、鲈亚目(Porcoidei)、太阳鱼科(Cehtrachidae)、黑鲈属(Micropterus)。加州鲈具有较强的适应性，并且有个体大、生长快、易起捕、养殖周期短等优点，加之肉质鲜美细嫩，无肌间刺，外形美观，深受世界各地养殖者和消费者欢迎。国内广东省1983年首次引进加州鲈，现已成为我国淡水养殖的重要名贵品种，广泛养殖于长江以南各省(如广东、浙江、江苏和四川等)，年总产量在16-20万吨。在消费市场，作为鳜鱼、大菱鲆、翘嘴红舶等高档鱼类的替代品，加州鲈属于中档鱼类。加之加州鲈活体上市，在酒楼饭店水族箱中还可让就餐者观赏挑选，符合国人饮食习惯，非常适合家庭和普通饭店消费，在我国具有很大的市场竟争力，十分畅销。

近年来，随着加州鲈养殖业的迅猛发展，其养殖密度也不断提高。随之而来的养殖水质恶化、种质退化等问题导致加州鲈传染性疾病频发，给养殖户造成巨大的经济损失，且有逐年加重的趋势。同时，病害频发导致药物滥用现象较为普遍，水产品质量安全得不到有效保障，给整个产业的可持续发展带来严重影响。加州鲈常见疾病有十几种，如溃疡综合征病、肝脾肿大病、烂鳃病、肠炎病、腐皮病、水霉病、车轮虫病、杯体虫病等，病原体包括病毒、细菌、真菌和寄生虫。其中，由病毒引起的溃疡综合征病发病急、死亡率较高，给养殖者造成的损伤较大，已成为加州鲈养殖产业的严重威胁。目前已明确该病害由虹彩病毒科蛙病毒属(Ranavirus)虹彩病毒引起。对该病毒，我国目前尚无商品化的疫苗，也没有特效的防治药物。

随着分子生物学相关学科的迅速发展，越来越多的分子检测技术已应用于病原微生物的检测。针对加州鲈蛙病毒属虹彩病毒，已有普通PCR、多重PCR及荧光定量PCR检测方法的报道，检测限量可达10⁴个病毒粒子/μL。虽然这些分子诊断技术具有一定的敏感性，特异性也较强，并且可大批量检测及避免主观偏差等优点，部分解决了快速检测的需求，但由于试验过程需要专业技术人员及PCR基因扩增仪、杂交仪等昂贵的仪器设备而造成一定的局限性，在实际现场应用中还存在许多困难，难以在基层或者一线养殖场推广，建立简便、快捷、灵敏的可视化现场检测技术十分必要。

与上述方法相比，比色生物传感器近年来受到了广泛的关注。金纳米粒子具有易合成、长期稳定、与表面官能团相容性好、光学性质与距离有关等优点，已被广泛应用于比色生物传感器的研究。AuNPs呈红色，在分散状态下是稳定的，这是由于表面带负电荷的柠檬酸盐阴离子所产生的静电斥力。通过盐的加入，Na⁺会中和柠檬酸阴离子的负电荷，从而发生AuNPs聚合。因此，由于表面等离子体共振峰在聚集态下向较长的波长移动，使溶液呈现紫色或蓝色。寡核苷酸与AuNPs表面的结合即使在相对高盐浓度下也能稳定AuNPs，因为DNA聚合物和柠檬酸盐阴离子的负电荷形成了排斥电双层。因此，寡核苷酸功能化的AuNPs可以通过DNA杂交选择性聚合，DNA反应由AuNPs的颜色表示。

然而，目前没有研究涉及AuNPs在LMBV检测中的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供大口黑鲈蛙病毒属虹彩病毒胶体金可视化检测方法及所用的探针。