[发明专利]用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法及应用

说明书

本发明涉及用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法及应用，属于生物技术领域。本发明采用信息分析技术，对29种在CHO细胞中常用的高分泌表达信号肽和外源蛋白串联序列进行分析，最终选择分析结果合适的10种信号肽，通过PCR方法将10种不同的分泌型信号肽与串联表位基因的5’端相连，分别构建了真核表达载体并转染哺乳动物细胞CHO,采用Western blot检测CHO培养基中重组表位蛋白的累积差异,结果证明蛋白累计差异与本方法选择结果相符合，从而证明了所述方法的可行性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，进一步，涉及信号肽，具体地，涉及一种用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法及应用。

背景技术

中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)是表达药用生物活性大分子的首选，CHO很少分泌自身的内源蛋白，有利于蛋白的纯化。分泌表达是CHO的主要表达途径，但许多蛋白质(细胞因子等)的表达相对较低，增加细胞分泌的能力能显著促进重组蛋白的表达。

在CHO细胞表达分泌性蛋白质过程中，起初会合成由15-30个疏水性氨基酸组成的信号肽，信号肽随后被细胞质中的信号识别颗粒(Signal-Recognition Particle,SRP)所识别，识别后导致蛋白质合成暂停，随后核糖体与内质网膜结合，信号肽依靠其疏水性插入内质网膜腔内,在核糖体结合内质网膜后SRP将会离开，处于暂停状态的蛋白质合成重新开始。而后信号肽酶对信号肽进行切割。一个合适的信号肽有助于提高重组蛋白的表达水平。但是，信号肽和外源蛋白N端相连会发生切割位点的偏移，发生切割目的蛋白氨基酸的可能。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的之一在于提供一种用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法，通过该方法可以选择适合外源目的蛋白外分泌表达的信号肽。本发明的目的之二在于提供所信号肽的选择方法在表达O型口蹄疫病毒重组表位蛋白过程中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

用中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白时信号肽的选择方法，其特征在于：首先选取能在中国仓鼠卵巢细胞中高分泌表达蛋白的信号肽作为待选择信号肽；将待选择信号肽分别与外源目的蛋白进行串联，获得重组蛋白；通过信号肽分析工具分析重组蛋白的氨基酸序列，选择切割位点分析准确的重组蛋白序列上的信号肽，即为适合外源目的蛋白外分泌表达的信号肽。

作为对上述方案的进一步优化，在所述待选择信号肽与外源目的蛋白进行串联时，在待选择信号肽与外源目的基因之间引入GGSSGG间隔子；通过信号肽分析工具分析后选择切割位点分析准确且落在间隔子上的重组蛋白。

作为对上述方案的更进一步优化，在所述外源目的蛋白含有多个表位时，在每两个相邻的表位之间引入GGSSGG间隔子。

本发明还请求保护所述信号肽的选择方法在中国仓鼠卵巢细胞分泌表达外源目的蛋白中的应用。

进一步地，所述应用是利用所述信号肽选择方法选择适合O型口蹄疫病毒重组表位蛋白表达的信号肽，包括以下步骤：

步骤一、选择O型口蹄疫病毒VP1蛋白的21～60AA、141～160AA和200～213AA作为优势表位；连接三个所述优势表位构建多表位基因表达盒；其中，在连接三个所述优势表位时在每两个相邻的优势表位之间引入GGSSGG间隔子；

步骤二、从已报道的文献中选取能有效分泌表达外源目的基因的信号肽作为待选择信号肽，将待选择信号肽分别与步骤一所得多表位基因表达盒连接，连接时在待选择信号肽和多表位基因表达盒之间分别选用引入GGSSGG间隔子和不引入GGSSGG间隔子两种连接方式，获取重组蛋白；

步骤三、使用信号肽分析工具分析步骤二所得重组蛋白的氨基酸序列，选择切割位点分析准确且落在间隔子上的信号肽，即为适合O型口蹄疫病毒蛋白表达的信号肽。