[发明专利]一种两性离子修饰的功能化树状大分子负载α-TOS包裹金纳米颗粒用于基因转染的方法

权利要求书

1.一种两性离子修饰的功能化树状大分子负载α-TOS包裹金纳米颗粒用于基因转染的方法，包括：

(1)将1,3-丙烷磺内酯1,3-PS逐滴加入含有第5代聚酰胺胺树状大分子G5.NH₂的DMSO溶液中，室温搅拌24～30小时，得到G5.NH₂-1,3-PS；

(2)取叶酸FA溶于DMSO中，加入EDC和NHS活化；然后将溶液逐滴加入到NH₂-PEG-COOH的DMSO溶液中，室温搅拌72～78小时，得到FA-PEG-COOH；

(3)取维生素E琥珀酸生育酚酯α-TOS溶于DMSO中，加入EDC和NHS活化；然后将上溶液逐滴加入到NH₂-PEG-COOH的DMSO溶液中，室温搅拌72～78小时，经透析纯化，得到TOS-PEG-COOH；

(4)将步骤(2)得到的FA-PEG-COOH和步骤(3)得到的TOS-PEG-COOH配制成水溶液，经EDC和NHS活化后，依次加入G5.NH₂-1,3-PS溶液中，反应72～78小时，经透析，冷冻干燥，得到树状大分子G5.NH₂-1,3-PS-(PEG-FA)-(PEG-TOS)；

(5)将G5.NH₂-1,3-PS-(PEG-FA)-(PEG-TOS)分别配制成水溶液，分别加入氯金酸溶液，搅拌20～30分钟，然后分别加入硼氢化钠溶液搅拌反应3～4小时，经透析，冷冻干燥，得到{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-1,3-PS-(PEG-FA)-(PEG-TOS)}DENP_s，记为L1；

(6)按照相应的N/P比，取L1用无菌水稀释，并用无菌水稀释质粒DNA，然后混合均匀，37℃孵育20～30分钟，得到不同N/P比的L1/pDNA；其中N/P比为树状大分子的伯氨基与pDNA骨架上磷酸基团的摩尔比为1:10-1:40；

(7)将RAW264.7细胞种于12孔板上，于37℃、5％CO₂培养24～36小时，加入LPS溶液孵育24～36小时，更换成含血清培养基或者无血清培养基，加入步骤(6)中所得的L1/pDNA复合物，混合均匀，在培养基箱中培育4～6小时，然后将培养基换成有血清的培养基继续培养24～36小时，检测基因的转染效率。

2.根据权利要求1所述的基因转染方法，其特征在于：所述步骤(1)中的G5.NH₂与1,3-PS的质量比为1:20。

3.根据权利要求1所述的基因转染方法，其特征在于：所述步骤(2)中的FA、NH₂-PEG-COOH、EDC和NHS的摩尔比为1:1:5:5。

4.根据权利要求1所述的基因转染方法，其特征在于：所述步骤(3)中的α-TOS、NH₂-PEG-COOH、EDC和NHS的摩尔比为1:1:5:5。

5.根据权利要求1所述的基因转染方法，其特征在于：所述步骤(4)中FA-PEG-COOH与G5.NH₂-1,3-PS的摩尔比为10:1；EDC和NHS与FA-PEG-COOH的摩尔比为5:5:1；TOS-PEG-COOH与G5.NH₂-1,3-PS的摩尔比为10:1；EDC和NHS与TOS-PEG-COOH的摩尔比为5:5:1。

6.根据权利要求1所述的基因转染方法，其特征在于：所述步骤(5)中G5.NH₂-1,3-PS-(PEG-FA)-(PEG-TOS)与氯金酸和硼氢化钠的摩尔比为1：25：75。

7.根据权利要求1所述的基因转染方法，其特征在于：所述步骤(7)中无血清培养基为DMEM培养基；有血清的培养基为10％FBS的DMEM培养基；pDNA为带有增强的绿色荧光蛋白EGFP基因的质粒。