[发明专利]一种两性离子修饰的功能化树状大分子负载α-TOS包裹金纳米颗粒用于基因转染的方法

说明书

本发明涉及一种两性离子修饰的功能化树状大分子负载α‑TOS包裹金纳米颗粒用于基因转染的方法，包括：(1){(Au⁰)₂₅‑G5.NH₂‑1,3‑PS‑(PEG‑FA)‑(PEG‑TOS)}DENP_S的制备；(2){(Au⁰)₂₅‑G5.NH₂‑1,3‑PS‑(PEG‑FA)‑(PEG‑TOS)}DENP_S/pDNA的制备、表征及基因转染研究。本发明制备方法简单，易于操作，得到的纳米颗粒具有基因转染效率高、特异性强等优点，在类风湿关节炎化疗与基因治疗等方面具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于多功能高分子纳米载体领域，特别涉及一种两性离子修饰的功能化树状大分子负载α-TOS包裹金纳米颗粒用于基因转染的方法。

背景技术

基因治疗是指一定的载体或手段将功能性外源基因导入受体细胞中，通过外源基因的表达产物或外源基因抑制靶基因的转录或翻译，从而介入疾病的治疗。然而，目前基因治疗主要的障碍就是缺乏一种安全高效的载体。在基因载体系统中，主要包含病毒载体和非病毒载体。病毒载体转染效率高，但是生物安全性较差。非病毒载体，由于其低细胞毒性、无免疫原性、高基因上载量等优点，备受研究者关注。

非病毒载体中，聚酰胺胺树状大分子(PAMAM)是目前研究最深入的树状大分子之一，高度支化的三维立体结构和丰富的表面氨基令其被广泛应用于基因传递。研究表明，PAMA M的基因传递转染效率和细胞毒性随着其代数的增加而增加。而第五代PAMAM虽然具有一定的毒性，但可以通过内部包裹金纳米颗粒(Shan et al.,Biomaterials,2012,33(10),3025-3035) 或进行表面靶向配体和两性离子修饰(Kong et al.,Nanomedicine,2016,11(23),3103-3115；Li u et al.,ACS Appl.Mater.Interfaces 2019,11,15212-15221)等手段降低其细胞毒性，通过提高靶向性和抗特异性蛋白吸附性能增强基因转染能力。

巨噬细胞在类风湿关节炎、结肠炎等炎症疾病的发生发展过程中起着至关重要的作用，类风湿关节炎病灶部位巨噬细胞倾向于M1型巨噬细胞极化，分泌大量促炎性细胞因子(TNF -α，IL-1β)等，加速机体炎症，造成关节软骨损坏。因此，针对于TNF-α等促炎性细胞因子的治疗制剂备受研究者关注。已有学者利用TNF-α特异的聚siRNA(poly siRNA)与巯基乙二醇壳聚糖(tGC)聚合物的纳米复合物(psi-tGC-NP_S)用于类风湿关节炎治疗。胶原诱导的关节炎模型小鼠静脉注射该纳米复合物后，其在关节炎关节部位高积累，显著抑制了关节炎症和软骨侵蚀(Lee et al.Mol.Ther.,2014,22(2)397-408)。

相关研究表明，活性氧(ROS)与机体的动脉粥样硬化、炎症、糖尿病等多种疾病的发生发展都有密切的关系。类风湿性关节炎(RA)关节滑膜中巨噬细胞氧气不足导致缺氧诱导因子(HIF-1α)的表达上调并诱导大量ROS的产生，ROS可以充分参与诱导M1型巨噬细胞的形成，加剧关节滑膜炎症(Kim et al.ACS Nano 2019,13,3206-3217)。M1型巨噬细胞(比如RAW264.7细胞)表面存在大量的叶酸受体FAR-β，能够与叶酸分子特异性结合。α-琥珀酸生育酚酯(α-TOS)是维生素E最主要成份α-生育酚(α-TOH)的一种酯化衍生物。α-TOS在体内水解后产生α-TOH，其β-色酮环上6位羟基可与氧自由基发生ROS反应，生成稳定的生育酚半醌自由基，因此α-TOS可作为一种高效的ROS清除剂。但是，由于α-琥珀酸生育酚酯自身特性(水溶性及药物特异性差)限制了其在炎症治疗中的应用。

检索国内外相关文献和专利结果表明：以聚乙二醇化的FA和两性离子修饰的包裹金纳米颗粒的聚酰胺-胺树状大分子为载体，同时负载α-TOS的制备方法，尚未见报道。

发明内容