[发明专利]耳念珠菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、TaqMan探针

说明书

本发明涉及耳念珠菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、TaqMan探针，具体地，本发明提出了rDNA基因作为耳念珠菌生物标志物的用途。耳念珠菌的rDNA基因ITS1‑ITS4为耳念珠菌保守序列，其中部分序列具有特异性，可作为理想的引物和探针设计模板，用于耳念珠菌核酸检测方法的研究。以耳念珠菌rDNA基因序列为生物靶标建立耳念珠菌的实时荧光定量PCR检测方法，对于临床上对耳念珠菌感染进行快速诊断具有非常重要的作用。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体地，本发明涉及耳念珠菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、TaqMan探针。

背景技术

耳念珠菌(Candida auris)是一种首次在日本报道的新病原，后来在全世界各地都有报道。基因分析显示一些耳念珠菌克隆株显示不同耐药性的机制。尽管加强了感染预防和控制措施，C.auris还是会引起重症监护室的院内爆发，其传播流行是一个特别令人关注的问题。以前，侵袭性念珠菌病主要由白色念珠菌引起，现在逐渐向非白假丝酵母转变，例如C.auris这种多重耐药物种，如氟康唑，经验性抗真菌治疗可能存在问题。C.auris能够在危重病人间迅速蔓延，有潜力成为一种占主导地位的机会性致病病原体。此外，使用常规表型和分子技术鉴定困难，不利于感染预防控制。对耳念珠菌进行早期诊断并加以及时治疗是预防侵袭性曲霉病相对有效的方法。因此，建立一种特异性高、准确、灵敏、快速、方便、成本低廉的耳念珠菌检测方法是降低侵袭性曲霉病发生和危害的重要途径。

C.auris在系统发育上与希木龙念珠菌(C.haemulonii)物种的同源性很高，报道显示C.haemulonii分离株经常被错误鉴别为C.auris。使用生色琼脂可以用来区分C.auris和C.haemulonii分离株，但是耗时长，远不能满足临床上对耳念珠菌进行快速准确检测的需要。尽管用于微生物鉴定的分子技术具有优势，但是在区分这两种真菌上可能出现偏差。例如基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)可导致C.anuris被错误鉴定为C.haemulonii和C.albicans。遗传基因座的测序，包括rRNA的D1/D2，RPB1，RPB2和内部转录间隔区(ITS)，已被证明可用于鉴定C.auris，但它不是实验室用于念珠菌属物种鉴定的常用技术。

因此，开发一种能够快速准确检测C.auris的方法将会很有前景。

发明内容

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了rDNA基因作为耳念珠菌生物标志物的用途。根据本发明的实施例，所述rDNA基因包括其ITS1-ITS4核苷酸序列。发明人发现，耳念珠菌的rDNA基因ITS1-ITS4为耳念珠菌保守序列，其中部分序列具有特异性，可作为理想的引物和探针设计模板，用于耳念珠菌核酸检测方法的研究。以耳念珠菌rDNA基因(SEQ IDNO：17)序列为生物靶标建立耳念珠菌的实时荧光定量PCR检测方法，对于临床上对耳念珠菌感染进行快速诊断具有非常重要的作用。

根据本发明的实施例，上述用途还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述rDNA基因包括其250-349位碱基序列。发明人发现，所述rDNA基因自5’端第250-349位碱基序列(SEQ ID NO：17中双下划线部分)可以作为PCR检测中引物或探针特异性扩增的模板。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种用于PCR检测的引物组合物。根据本发明的实施例，所述引物组合物包括：

正向引物，所述正向引物具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，

TGATGTCTTCTCACCMATCTTC(SEQ ID NO：1)；

反向引物，所述反向引物具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，

TGAGGCGACACAAAACG(SEQ ID NO：2)。