[发明专利]一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，其特征在于，包括上游引物容器、下游引物容器、探针容器、数字PCR反应缓冲液容器、阳性对照容器和阴性对照容器；

所述上游引物容器内具有上游引物，所述上游引物具有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

所述下游引物容器内具有下游引物，所述下游引物具有如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；

所述探针容器内具有荧光探针，所述荧光探针具有如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，其特征在于，当上游引物的核酸序列为SEQ ID NO.1时，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，所述荧光探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.5；当上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2时，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，所述荧光探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.6。

3.根据权利要求1所述的一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，所述3’ 端标记有荧光淬灭基团。

4.根据权利要求3所述的一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM；所述荧光淬灭基团为TAMRA。

5.根据权利要求1所述的一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，其特征在于，所述数字PCR反应缓冲液包括Taq酶、dNTP和镁离子。

6.根据权利要求1所述的一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为乙肝病毒DNA片段PCR扩增产物，所述阴性对照为超纯水、去离子水或不含乙肝病毒的血清。

7.如权利要求1-6任一项所述的高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒在HBV DNA检测中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取人血浆样本中的DNA，包括HBV DNA与游离的人基因组DNA，为待测样品；

（2）采用试剂盒中的引物与探针，配置PCR预备液，再分别加入等体积的待测样品，阳性对照和阴性对照，通过微滴发生器生成微滴后用于PCR反应；

（3）扩增完成后检测荧光信号，利用软件对PCR阳性和PCR阴性液滴进行计数，并进行数据分析。

8.根据权利要要求7所述的高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒在HBV DNA检测中的应用，其特征在于，所述步骤（3）中，当阳性对照测定结果大于100 copies/μl，阴性结果小于1 copies/μl，则所述待测样品的检测结果可用于判定待测样品中原始HBV DNA拷贝数。

9.根据权利要求7所述的高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒在HBV DNA检测中的应用，其特征在于，所述PCR预备液为：

2X数字PCR反应缓冲液包括Taq酶、dNTP和镁离子 10ul

10X引物，探针组合 1ul

去离子水 9ul。

10.根据权利要求9所述的高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒在HBV DNA检测中的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：

95℃下保持10分钟；

94℃反应30 s，60℃反应1min，循环40次；

98℃下10分钟，并冷却至4℃，升降温速度为2℃/s。