[发明专利]一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括上游引物容器、下游引物容器、探针容器、数字PCR反应缓冲液容器、阳性对照容器和阴性对照容器；本发明利用数字PCR对样品中目标核酸的含量进行绝对定量的方法，精确的测定HBV DNA的量，使其可以广泛的应用于生物、农业、医药等领域，特别是在人乙肝病毒检测方面具有良好的发展前景。

技术领域

本发明属于病毒核苷酸检测领域，具体涉及种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒及其应用。

技术背景

乙肝病毒是一种双链DNA病毒。体内检测到乙肝病毒DNA，此人就可以确定为乙肝病毒感染者。乙肝病毒DNA数量是判断乙肝病毒复制活跃程度的最可靠的方法。血液中乙肝病毒DNA较少，说明乙肝病毒复制得到抑制，传染性较弱；血液中乙肝病毒DNA较多，说明乙肝病毒复制活跃，传染性较强。其定量检测对于治疗方案的制定以及治疗效果的判断有着重要的意义。

近几年发展起来的定量核酸检测方法可以对病毒核酸进行相对的定量检测，对于药物治疗效果的评价和病毒复制活性的判定很有意义。目前为止，定量检测HBV DNA的方法很多，但还没有统一的检测标准，常用的定量检测方法主要是荧光定量PCR法，但是荧光定量PCR法的数据处理复杂，需要参考物或标准品，且易受PCR抑制剂影响，同时光定量PCR法在测定低滴度的乙肝病毒时，误差较大，灵敏度不高。

发明内容

针对上述情况，本发明公开了一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒及其应用，可以不需要标准品，简化了操作，灵敏度高，并且实现了对病毒核酸的绝对定量。

为了实现上述发明的目的，本发明公开了一种高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，包括上游引物容器、下游引物容器、探针容器、数字PCR反应缓冲液容器、阳性对照容器和阴性对照容器；

所述上游引物容器内具有上游引物，所述上游引物具有如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列；

所述下游引物容器内具有下游引物，所述下游引物具有如SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列；

所述探针容器内具有荧光探针，所述荧光探针具有如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

上下游引物为NCBI数据库中现有引物对中产物长度适当的，根据上下游引物及目标DNA序列设计探针引物。

进一步的，上述高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，当上游引物的核酸序列为SEQ ID NO.1时，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，所述荧光探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.5；当上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2时，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，所述荧光探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.6。

进一步的，上述高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，所述荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，所述3’端标记有荧光淬灭基团。

进一步的，上述高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，所述荧光报告基团为FAM；所述荧光淬灭基团为TAMRA。当待测样品中不存在目标DNA分子时FAM的荧光被TAMRA淬灭，不发出荧光；当待测样品中存在目标DNA分子时，探针与目标DNA分子结合，随后靠Taq酶的5'→3‘双链外切酶活性降解探针而释放荧光基团FAM，发出荧光。

进一步的，上述高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，所述数字PCR反应缓冲液包括Taq酶、dNTP和镁离子。

进一步的，上述高灵敏度HBV DNA数字PCR定量检测试剂盒，所述阳性对照为乙肝病毒DNA片段PCR扩增产物，所述阴性对照为超纯水、去离子水或不含乙肝病毒的血清。