[发明专利]鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株、构建方法与应用

权利要求书

1.鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株RA CH-1△fur，即鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)CH-1△fur，于2019年8月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2019600。

2.权利要求1所述鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株RA CH-1△fur的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)RA CH-1 fur基因左右同源臂及Spec抗性基因的PCR扩增：以RA CH-1基因组作为模板，利用SEQ ID NO.1～4所示的两对引物fur-L F/R和fur-R F/R，PCR扩增fur基因左右同源臂片段fur-L和fur-R，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；以核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7所示的质粒pBAD24::SpecR作为模板，利用SEQ ID NO.8～9所示的引物对，PCR扩增SpecR序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

(2)fur-LSR融合片段的构建：用融合PCR技术构建融合片段fur-LSR，即fur-L+SpecR+fur-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

(3)RA CH-1fur基因缺失株的构建：向RA CH-1株培养所得菌悬液中加入fur-LSR融合片段，孵育，稀释后涂布于含壮观霉素的GCB固体培养基上培养24h-48h后，即得RA CH-1fur基因缺失株。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，RA CH-1fur基因左右同源臂的PCR扩增条件为：98℃变性30s，经98℃10s，55℃30s，72℃30s循环扩增30次，72℃延伸7min。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，壮观霉素抗性基因SpecR的PCR扩增条件为：98℃变性30s，经98℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 50s循环扩增30次，72℃延伸7min。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)的具体方法是：用融合PCR技术构建融合片段fur-LSR：回收的基因片段fur-L、SpecR、fur-R，经Nanodrop 2000测定浓度，以2:1:2的质量比混合作为PCR扩增的模板，融合PCR前5个循环不加入引物，后25个循环加入引物fur-L F和fur-R R。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，PCR反应条件为：98℃变性30s，经98℃10s，55℃ 30s，72℃ 1min30s循环扩增30次，72℃延伸7min。

7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)的具体方法是：将RA CH-1株在GCB液体培养基培养至对数生长期并将菌液调整至OD600＝1；取出300μL菌悬液加入1μg的fur-LSR，37℃孵育1小时后吸取100μL，稀释10⁴～10⁶倍后涂布于含80μg/mL壮观霉素的GCB固体培养基上，培养24～48小时。