[发明专利]鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株、构建方法与应用

说明书

本发明涉及一种鸭疫里默氏杆菌CH‑1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株、构建方法与应用，本发明构建的弱毒株RA CH‑1△fur免疫雏鸭后，对雏鸭无明显的病理损伤；对雏鸭的体重增殖无明显的影响，具有良好的安全性。RA CH‑1△fur免疫雏鸭后对RA CH‑1野生型强毒株的攻毒保护率达100％，具有良好的免疫保护。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株、构建方法与应用。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的一种主要感染鸭、鹅、火鸡等多种禽类的急性或慢性的接触性传染病。该病分布范围广，已成为严重危害我国养鸭业的细菌性传染病之一。目前防控该病主要通过注射灭活疫苗和药物防治。灭活疫苗制备工艺繁琐，需要多次注射才能达到保护效果；药物防治易使细菌对药物产生耐药性及对环境造成污染，而且在目前“减抗限抗”趋势下，抗生素药物的使用将会被进一步限制。所以，急需开发一种能够注射一次且具有良好保护效果的基因工程弱毒疫苗。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株、构建方法与应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、本发明提供了鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株RA CH-1△fur，即鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)CH-1△fur，于2019年8月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2019600。

2、本发明提供了上述鸭疫里默氏杆菌CH-1株fur基因缺失弱毒疫苗候选株RA CH-1△fur的构建方法，具体步骤如下：

(1)RA CH-1 fur基因左右同源臂及Spec抗性基因(壮观霉素抗性基因，SpecR)的PCR扩增：以RA CH-1基因组作为模板，利用SEQ ID NO.1～4所示的两对引物fur-L F/R和fur-R F/R，PCR扩增fur基因左右同源臂片段fur-L和fur-R，它们的核苷酸序列分别如SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示；以核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7所示的质粒pBAD24::SpecR作为模板，利用SEQ ID NO.8～9所示的引物对，PCR扩增SpecR序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示；

(2)fur-LSR融合片段的构建：用融合PCR技术构建融合片段fur-LSR，即fur-L+SpecR+fur-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

(3)RA CH-1 fur基因缺失株的构建：向RA CH-1株(Wang et al.,BMCGenomics.2014 Jun 17；15:479)培养所得菌悬液中加入fur-LSR融合片段，孵育，稀释后涂布于含Spec的GCB固体培养基上，培养，即得；

质粒pBAD24::SpecR，即大肠杆菌(Escherichia coli)XL1-Blue pBAD24::SpecR，于2019年10月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2019746；

其中，各序列如下：

fur-L F:ATCACGAAACTCTTGGCAGCCTCAAC，如SEQ ID NO.1所示；

fur-L R:CGTTATTAGTTATAGTTATTATAACATGTATTCACGAACCTTGATATTCCATCGAGTC，如SEQ ID NO.2所示；