[发明专利]一种猪α-干扰素的后提取工艺

说明书

本发明涉及一种猪α‑干扰素的后提取工艺，属于禽畜药物生产技术领域。该工艺包括：S1.将含有猪α‑干扰素的发酵液离心，保留上清液；S2.将上清液通过50KDa陶瓷膜过滤，再将滤出液通过10KDa陶瓷膜过滤，收集截留液；S3.向步骤S2的截留液中加入等体积的Ni²⁺‑IDA‑葡聚糖载体和NaCl溶液，进行吸附反应，得到反应液；S4.向步骤S3的反应液中加入等体积的磷酸盐缓冲液，混匀后通过50KDa陶瓷膜过滤，收集截留液；S5.向步骤S4的截留液中加入洗脱液，然后通过30KDa陶瓷膜过滤，收集滤出液；S6.将步骤S5的滤出液通过10KDa陶瓷膜过滤脱盐，收集截留液，即得猪α‑干扰素，得率为62％以上，纯度为98％以上，活性收率为100％。

技术领域

本发明涉及一种猪α-干扰素的后提取工艺，属于禽畜药物生产技术领域。

背景技术

我国是世界养猪大国，2018年出栏超69382万头，每年因病毒性疾病的爆发，给生猪养殖业造成上百亿元损失。急需寻求一种高效、安全以及无毒副作用的猪病毒性疾病防治新产品。目前市场上使用最多的是猪白细胞干扰素，由四川世红生物技术有限公司通过诱生方法生产，于1997年获得农业部新兽药证书[(97)新兽药证字第01号]。

目前已经可以利用大肠杆菌和毕赤酵母成功地表达出重组干扰素，但是至今在我国未有重组的猪干扰素获得新兽药证书，也未有进口的重组猪干扰素获得进口注册证书。其中很大的障碍就是干扰素的后提取工艺。后提取工艺的目的是为了获得纯度较高的干扰素，目前常用的方法分为两步，一是初步纯化，例如盐析、等电点、有机溶剂沉淀等；二是精度纯化，常用的有液相色谱法、金属亲和层析、离子交换、疏水层析和凝胶过滤层析以及反相作用色谱法。现有的猪α-干扰素后提取工艺复杂，纯度低，收率差，成本高。目前还没有较为理想的后提取工艺来获得高纯度的猪α-干扰素。

发明内容

为弥补上述领域存在的不足，本发明以毕赤酵母为生产菌株，通过对发酵液进行离心、膜分离的初步纯化以及亲和-膜过滤的精度纯化，使猪α-干扰素纯度高达99％，蛋白得率达到62.35％，活性收率达到100％。

本发明提供一种猪α-干扰素的后提取工艺，其特征在于，包括步骤：

S1.将含有猪α-干扰素的发酵液离心，弃菌体，保留上清液；

S2.将上清液先通过50KDa分子量陶瓷膜过滤，收集滤出液；再将所述滤出液通过10KDa分子量陶瓷膜过滤，收集截留液；

S3.向步骤S2的截留液中加入等体积的Ni²⁺-IDA-葡聚糖载体和NaCl溶液，进行吸附反应，得到反应液；

S4.向步骤S3的反应液中加入等体积的磷酸盐缓冲液，混匀后通过50KDa分子量陶瓷膜过滤，收集截留液；

S5.向步骤S4的截留液中加入洗脱液，对猪α-干扰素进行洗脱，然后通过30KDa分子量陶瓷膜过滤，收集滤出液；

S6.将步骤S5的滤出液通过10KDa分子量陶瓷膜过滤脱盐，收集截留液，即得猪α-干扰素原液。

在一些实施例中，所述步骤S2中，所述通过50KDa分子量陶瓷膜过滤的过滤压力为：进口压力0.5MPa，出口压力0.2MPa，上清液流速为1m³/h；所述通过10KDa分子量陶瓷膜过滤的过滤压力为：进口压力0.5MPa，出口压力0.25MPa，滤出液流速为1.2m³/h。

在优选实施例中，所述步骤S3中，加入等体积的4mg/mL Ni²⁺-IDA-葡聚糖载体，加入NaCl溶液使反应体系中的NaCl终浓度为0.9mol/L，调节pH值为8.0，30℃恒温水浴，以500rpm/min的速度搅拌反应30min，得到反应液。