[发明专利]鸡细小病毒与H9亚型禽流感病毒二重PCR检测引物组、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了鸡细小病毒与H9亚型禽流感病毒二重PCR检测引物组、试剂盒及方法，设计了针对鸡细小病毒与H9亚型禽流感病毒的特异性引物，经过对不同引物组合进行试验筛选得到扩增效果较好的一个引物组合，然后继续对反应体系中引物浓度、引物之间的比例、退火温度和扩增时间进行优化，最终建立起可同时检测鸡细小病毒与H9亚型禽流感病毒的方法。本发明的引物和检测方法通过一次PCR反应便可同时确定样品中鸡细小病毒与H9亚型禽流感病毒的混合感染及单一感染情况，该方法同时具有特异性强、灵敏度高、快速简便及易于操作等优点，十分适于在基层单位应用推广，为鸡细小病毒与H9亚型禽流感病毒的监测及其防控提供技术支撑。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及鸡细小病毒与H9亚型禽流感病毒二重PCR检测引物组、试剂盒及方法。

背景技术

鸡细小病毒(chincken parvovirus，ChPV)是引发鸡群发生肠道疾病的重要病毒之一，临床上以腹泻、呈现精神抑郁和生长迟缓及料肉比增加等为特征。ChPV主要侵害雏鸡，主要造成患病鸡腹泻和发育不良，该病毒在某些鸡群中普遍存在，研究发现在发育障碍与矮小综合征鸡群的血清中能检测出ChPV DNA。流行病学调查表明其在商品肉鸡感染率较高、蛋鸡或种鸡次之。近年来研究表明ChPV在全球多个国家的鸡群中普遍存在，且近年来相继在北美的美国和巴西、东欧的波兰和匈牙利、克罗地亚及亚洲的韩国和中国等地区发现报道。

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是正黏病毒科中A型流感病毒属成员。根据其表面抗原血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶蛋白(Neuraminidase,NA)的差异可以将AIV划分为16种不同的HA亚型(H1～H16)和9种不同的NA亚型(N1～N9)。依据AIV对鸡致病性的强弱，AIV还可以分为高致病性AIV(HPAIV)和低致病性AIV(LPAIV)。H9亚型禽流感病毒自1966年在美国首次被发现，随后我国广东地区也于1994年首次在发病鸡体内发现了该亚型AIV。研究表明H9亚型AIV容易与其他病原(病毒和细菌等)混合感染，进而给我国养禽业造成更为严重的损失；其与其它不同亚型AIV混合感染时，毒株之间容易发生基因片段重组，并产生一些不可预知的新型禽流感病毒，进而可能引起新型禽流感病毒的大流行。2013年以来的部分报道还表明其可为H5N6和H7N9等高致病性亚型AIV的提供内部基因。

由上述报道可见，H9亚型AIV与ChPV都对家禽养殖业造成了严重的危害。

鸡细小病毒在正常鸡胚和细胞培养中难以大量增殖，因此应用病毒分离及电镜观察等方法对该病进行诊断的难度很大。

传统的禽流感病毒检测方法是将病毒分离培养后再进行血清学方法鉴定，培养周期长，且要用到较多标准阳性血清，但是禽流感病毒不同亚型血清相互之间又存在不同程度的交叉免疫保护反应，其结果的准确性具有局限性，所以目前禽流感病毒较多的采用分子生物学方法进行检测。分子生物学方法特别是RT-PCR检测技术具有快速、简便和准确等优点，在禽流感的诊断及大规模监测过程中应用广泛。由于AIV感染动物后具有相似的临床症状，混合感染的现象也普遍存在，所以在日常诊断中难以及时准确的对其进行鉴别确诊。近年来，随着分子生物学技术的发展，多重PCR技术的应用也越来越多，多重PCR具有可以同时对多种病原体混合感染进行检测的优点，不但克服了常规单一PCR需要对混合感染样品进行逐项检测耗时长的缺点，而且多重PCR诊断技术的不断完善和发展进步，该技术已被成熟应用于多种禽病及其它动物病原混合感染的诊断。

发明内容

本发明的目的是提供鸡细小病毒与H9亚型禽流感病毒二重PCR检测引物组、试剂盒及方法。

为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：本发明提供一种可通过二重PCR检测鸡细小病毒与H9亚型禽流感病毒的引物组，包括引物H9-F、引物H9-R、引物ChPV-F和引物ChPV-R。