[发明专利]一种β-葡萄糖苷酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及一种β‑葡萄糖苷酶突变体及其应用，通过全质粒PCR对原有野生型Bacillus cereus W23Q的β‑葡萄糖苷酶进行定点突变，制备单突变体库；采用PCR体系和程序进行全质粒PCR，结束后采用Dpn I酶消除模板，再将质粒转化到大肠杆菌Top10中，培养提取质粒保存并送测序；确定突变成功后，将质粒转化到表达宿主大肠杆菌BL21中，培养、诱导表达，即得到β‑葡萄糖苷酶突变体。该突变体较野生酶能大幅度提高催化Rg3转化Rh2的效率。应用该菌种生产Rh2，能降低成本，便于工业化应用。

技术领域

本发明属于酶学技术领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶突变体及其应用。

背景技术

人参是一种名贵药材，也是传统中药，具有良好的药用价值。人参的主要活性成分是人参皂苷，其主要成分有Rb1、Rb2、Rc、Rd及Rg3等，其中Rh2的含量十分稀少，因此也被称为“稀有皂苷”，Rh2具有多种功效，其具有与化疗药物联用增效减毒，在治疗肿瘤的过程中，发现临床化疗失败常与肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性有关，人参皂苷Rh2可以作为肿瘤耐药逆转剂，可提高化疗药物的抗肿瘤活性。因此，天然产物Rh2具有广泛的市场。

人参皂苷Rh2虽然具有优越的抗癌性能，但由于它本身是一个天然产物，分子十分复杂，直接合成有不小的困难。在天然产物中其含量极低，所以价格昂贵，水溶性差不易吸收也限制了它的大量使用。目前，提取和合成人参皂苷Rh2有全细胞催化、酸水解等的方式，然而其效率很低，副产物多，不适宜工业化放大生产。

从近年来β-葡萄糖苷酶的应用可以发现，目前为止其水解活性被广泛研究，能够水解人参皂甙与橄榄苦苷等天然产物，同时具备合成烷基糖苷的能力。

发明内容

本发明的目的是提供一种β-葡萄糖苷酶突变体，以及将该突变体用于合成人参皂苷Rh2的方法。

实现本发明目的的技术方案是：

一种β-葡萄糖苷酶突变体，所述β-葡萄糖苷酶来源于野生型的Bacillus cereusW23Q，β-葡萄糖苷酶突变体的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示，或者为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经以下至少一种突变情况所得：

将第197位的丙氨酸A突变为天冬氨酸D，简称A197D；

或/和将第246位的缬氨酸V突变为天冬氨酸D，简称V246D；

或/和将第295位的天冬氨酸D突变为天冬酰胺N，简称D295N；

或/和将第304位的酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F，简称Y304F；

或/和将第360位的天冬酰胺N突变为天冬氨酸D，简称N360D；

或/和将第489位的异亮氨酸I突变为缬氨酸V，简称I489V。

所述的β-葡萄糖苷酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

（1）通过反向PCR对原有野生型Bacillus cereus W23Q 的β-葡萄糖苷酶进行定点突变，制备单突变体库；

（2）采用PCR体系和程序进行全质粒PCR，结束后采用Dpn I酶消除模板，再将质粒转化到大肠杆菌Top10中，培养提取质粒保存并送测序；

（3）确定突变成功后，将质粒转化到表达宿主大肠杆菌BL21中，培养、诱导表达，即得到β-葡萄糖苷酶突变体。

本发明的另一个目的是，提供了所述β-葡萄糖苷酶突变体在合成人参皂苷Rh2中的应用。