[发明专利]一种红斑丹毒丝菌的检测方法及其引物和探针

说明书

本发明属于分子生物学检测领域，公开了一种检测红斑丹毒丝菌的引物和探针，所述引物和探针的序列为：F‑引物：5’‑CCGAATTTGCTTACCGCTTGAAGGTTAAAGCAGGC‑3’，R‑引物：5’‑GTCCAAATTGAATAGTTTTCTATATACATAAGATC‑3’；探针：5’‑AGGTCTAGCGCAGATCGAGGGTAAGTACAATAATCTCCAAAAGATAA‑3’；所述探针上标记有荧光基团、淬灭基团和THF，所述荧光基团与所述淬灭基团均标记在T碱基上，所述荧光基团与所述淬灭基团的间距为1～5nt；所述荧光基团与所述淬灭基团之间设有所述THF，所述THF距所述探针5’端≥30nt，所述THF距所述探针3’端≥15nt。本发明还公开了采用上述引物和探针的红斑丹毒丝菌的检测方法。本发明所述检测方法的特异性强、灵敏度高、稳定性好，还具有简便、快速的特点。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种红斑丹毒丝菌的检测方法及其引物和探针。

背景技术

猪丹毒(Swine erysipelas)又称猪丹毒丝菌病或猪丹毒杆菌病，是猪感染红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)引起的急性、热性传染病，常导致猪的急性死亡，给养殖业造成了严重的损失。而且，该疾病是一种条件性人畜共患病，红斑丹毒丝菌可通过伤口感染接触到病猪的人员，因此对饲养员和屠宰员也都可能造成危害。

由于丹毒丝菌属细菌的抵抗力和生长繁殖能力很强，常大量存在于圈舍的稻草中，在尸体中也能存活数月，不易被彻底消灭，因此猪丹毒属于防控难度较大的疾病类型。而农业部的行业标准《猪丹毒诊断技术》(NY/T 566-2002)中关于猪丹毒的检测方法只有病原分离和血清培养凝集试验，这两种方法对生物安全环境的要求比较高，普通实验室无法办法满足要求而且费时费力。同时，该检测方法费时费力，不适用于实际检测的需要，也不适用于大规模流行病学的调查。

因此，建立一种简便、快速、准确的红斑丹毒丝菌快速等温检测方法是十分有必要的。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测红斑丹毒丝菌的引物和探针，以及基于所述引物和探针的RAA(重组酶介导核酸扩增)检测方法。本发明所述检测方法的特异性强、灵敏度高、稳定性好，还具有简便、快速的特点。

一种检测红斑丹毒丝菌的引物，所述引物的序列为：

F-引物：5’-CCGAATTTGCTTACCGCTTGAAGGTTAAAGCAGGC-3’，

R-引物：5’-GTCCAAATTGAATAGTTTTCTATATACATAAGATC-3’。

一种检测红斑丹毒丝菌的探针，所述探针的序列为：

探针：5’-AGGTCTAGCGCAGATCGAGGGTAAGTACAATAATCTCCAAAAGATAA-3’；

所述探针上标记有荧光基团、淬灭基团和THF，所述荧光基团与所述淬灭基团均标记在T碱基上，所述荧光基团与所述淬灭基团的间距为1～5nt；所述荧光基团与所述淬灭基团之间设有所述THF，所述THF距所述探针5’端≥30nt，所述THF距所述探针3’端≥15nt。

其中所述THF为四氢呋喃，所述THF的数量为一个。

本发明根据红斑丹毒丝菌CPS基因的高度保守区域设计特异性引物和探针，共设计了多组不同的引物和探针组合，经过筛选和分析，从而确定上述引物和探针的检测效果最佳。

优选的，所述荧光报告基团包括FAM(羧基荧光素)、TET(四氯-6-羧基荧光素)、HEX(六氯-6-甲基荧光素)、CY3(3H-吲哚菁)或JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)。