[发明专利]Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及应用

权利要求书

1.一种Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

S1，确定Amy1基因的特异性靶位点sgRNA1和sgRNA4，并与Cas9核酸酶体外转录成mRNA；

S2，将有活性的sgRNA1、sgRNA4和Cas9RNA显微注射入小鼠受精卵中，获得Amy1基因敲除小鼠；

所述sgRNA1如SEQ ID NO:1所示，所述sgRNA4如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤S2包括以下步骤：

S21，小鼠促排卵和体外受精，培育受精卵；

S22，将有活性的sgRNA1、sgRNA4和Cas9RNA显微注射到小鼠受精卵中；

S22，受精卵体外培养、植入受体及靶向基因修饰动物的培育。

3.根据权利要求1或2所述的Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤S22包括以下步骤：

S221，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为F0代小鼠；

S222，提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增并将产物送测序；

S223，将阳性F0代小鼠与野生型异性小鼠交配获得F1代杂合子小鼠；

S224，将F1代杂合子小鼠杂交获得F2代纯合子小鼠，即为小鼠动物模型。

4.根据权利要求3所述的Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述阳性F0代小鼠Amy1基因删除了3.1kb个碱基。

5.根据权利要求4所述的Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述阳性F0代小鼠Amy1基因删除的碱基序列如SEQ ID NO.8所示。

6.根据权利要求3所述的Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增采用Amy1-seq-F+Amy1-seq-R2nn引物对；引物Amy1-seq-F的序列如SEQ ID NO.3所示；引物Amy1-seq-R2nn的序列如SEQ ID NO.4所示。

7.根据权利要求3所述的Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述F2代纯合子小鼠基因组序列如SEQ ID NO.9。

8.根据权利要求3所述的Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，用Amy1-seq-F+Amy1-seq-R2nn和Amy1-WT-F+Amy1-seq-R2nn两对引物对F2代小鼠进行PCR检测，鉴定出F2代纯合子小鼠；引物Amy1-seq-F的序列如SEQ ID NO.3所示；引物Amy1-seq-R2nn的序列如SEQ ID NO.4所示；引物Amy1-WT-F的序列如SEQ ID NO.5所示。

9.一种Amy1基因打靶载体，其特征在于，所述载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，sgRNA的作用位点的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

10.一种如权利要求9所述的sgRNA在构建糖尿病或代谢综合征相关的基因敲除小鼠动物模型中的用途。