[发明专利]Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法与应用；基于CRISPR/Cas9基因敲除技术构建Amy1基因敲除小鼠模型，其构建方法包括如下步骤：步骤一、设计sgRNA和Cas9 RNA并体外转录成mRNA，将有活性的sgRNA和Cas9 RNA显微注射入小鼠受精卵中，获得Amy1基因敲除小鼠；步骤二、对Amy1基因敲除小鼠动物模型的鉴定。其优点表现在：本发明使用CRISPR/Cas9基因敲除技术，首次建立了Amy1基因敲除的小鼠动物模型，为研究Amy1基因与相关疾病的关系提供便捷、可靠的动物模型。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9技术的Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及应用。

背景技术

小鼠Amy1基因，位于3号染色体反链上，全长24190bp，其编码唾液腺淀粉酶。唾液淀粉酶长度为511氨基酸，主要参与代谢碳水化合物，起到将淀粉水解为麦芽糖和葡聚糖的作用。唾液淀粉酶作用于a-1，4糖苷键，可将较大分子量且不溶的淀粉分子分解为可溶性的小颗粒(包括淀粉糊精、红糊精和无色糊精)，随后在胃中被胃酸灭活。而唾液淀粉酶的底物—淀粉以及其代谢过程的产物—短链葡萄糖均可起到部分保护唾液淀粉酶免于被胃酸灭活的作用。

目前关于Amy1的相关研究仍非常有限，根据现有的文献报道显示，Amy1主要在唾液腺中表达，在人正常肝组织和大部分的肿瘤组织中并未发现Amy1基因的表达，但在某些具有神经内分泌功能的肿瘤，如某些肺腺癌组织中可检测到Amy1的表达。临床上在血清样本中对于淀粉酶的检测主要检测胰腺淀粉酶或者胰腺淀粉酶和唾液淀粉酶的总量，淀粉酶水平的轻度升高常被认为与唾液腺疾病有关，而高水平的淀粉酶升高则提示胰腺炎或其他消化道疾病。另一方面，有报道显示Amy基因的表达与心理、生理应激有关，而唾液淀粉酶可被用作应激的指标，并有报道认为它可作为交感神经系统活动的无创生物学标志物。因此，从以上报道可以看出，该基因的表达可能与一些消化系统疾病有关。

规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas9)技术是基于对细菌和古细菌中的免疫系统改造而建立，通过导向RNA(sgRNA)介导核酸内切酶Cas9蛋白进行目标DNA序列识别并造成DNA双链断裂，促进以同源重组或非同源末端连接方式修复受损DNA，从而对目标位点实现基因的定点敲除、敲入以及基因修正等多种修饰。

由于其具有特异性高，分子构建简单，流程短的特点，近年来CRISPR/Cas9技术获得了快速发展。使用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除需要两个关键因素，首先是有效的sgRNA引导序列，再就是Cas9蛋白的存在。与锌指核酸酶(ZFN)技术和类转录样效应因子核酸酶(TALEN)技术相比，因其靶向编辑目标基因的特异性、高效性和设计的简便性等诸多优点得到越来越广泛的应用，在细菌、哺乳动物细胞以及斑马鱼、小鼠、大鼠等都表现出很强的基因组编辑活性。

中国专利文献CN107043787A公开了一种基于CRISPR/Cas9获得MARF1定点突变小鼠模型的构建方法。中国专利文献CN104293831A公开了一种基于CRISPR/Cas9基因敲除技术建立高血压小鼠模型的方法。中国专利文献CN105950639A公开了一种金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统的制备方法及其在构建基因修饰小鼠模型中的应用。中国专利文献CN106172238A公开了一种利用CRISPR/Cas9基因敲除技术建立miR-124基因敲除小鼠动物模型的方法。但是关于Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法目前还未见报道。

发明内容

本发明旨在基于CRISPR/Cas9技术提供一种Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及应用；本发明通过CRISPR/Cas9技术通过体外转录的方式，获得Cas9mRNA和sgRNA构建稳定敲除Amy1基因小鼠模型，第一次成功构建了该动物模型，为进一步研究Amy1的功能奠定了良好的基础。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：