[发明专利]Gateway克隆系统的植物表达载体及构建方法和应用

权利要求书

1.一种Gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法，其特征在于，所述Gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法以pK7GWIWG2D(II)或pK2GW7为骨架，两个载体分别使用SacI/KpnI和SacI/PmeI核酸内切酶进行双酶切；通过同源重组技术将其他Gateway系列载体构建入两个载体。

2.如权利要求1所述的Gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法，其特征在于，所述Gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法包括：

Gateway克隆系统的植物表达载体PKGMYC的构建方法将pEarleyGate203的35s-myc-attR1-ccdb-attR2-OCS terminal片段置换pK7GWIWG2D(II)部分片段形成PKGMYC；

Gateway克隆系统的植物表达载体pKCYFP和pKNYFP载体的构建方法包括：将pEarleyGate101的35s-attR1-ccdb-attR2-YFP-HA-OCS terminal或pEarleyGate104的35s-YFP-attR1-ccdb-attR2-OCS terminal片段置换pK2GW7的部分片段，分别形成PKCYFP和PKNYFP。

3.如权利要求2所述Gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法，其特征在于，所述Gateway克隆系统的植物表达载体PKGMYC的构建方法具体包括：

(1)设计引物；SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；使用NEB Phusion高保真聚合酶，以pEarleyGate203为模板，扩增得到片段F1；PCR反应程序为98℃30s；98℃10s，62℃30s，72℃4min，32个循环；72℃10min；

(2)使用SacI-HF和KpnI-HF核酸内切酶在37℃培养箱酶切pK7GWIWG2D(II)载体30min；

(3)PCR及酶切完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离片段，并使用Thermo Scientific的Gene JET Gel Extraction Kit并按照试剂盒说明书回收DNA片段；

(4)使用vazyme公司的ClonExpress II One Step Cloning Kit并按照说明书进行连接；37℃反应30min；

(5)连接完成后，将连接产物转化DB3.1热激感受态，同时转化TOP10热激感受态，检测ccdB致死情况；转化完成后涂布于Spec抗性的LB固体培养基，37℃倒置培养12-16h；第二天挑取单克隆，并用Spec抗性的LB液体培养基摇菌12h，使用天根质粒小提中量试剂盒提取质粒，并测序。

4.如权利要求2所述Gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法，其特征在于，所述Gateway克隆系统的植物表达载体pKCYFP和pKNYFP载体的构建方法具体包括：

设计引物；SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7；使用NEB Phusion高保真聚合酶，以pEarleyGate101或pEarleyGate104为模板，分别扩增得到片段F2和F3；

使用NEB公司的SacI-HF和PmeI核酸内切酶在37℃培养箱酶切pK2GW7载体30min；

PCR及酶切完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离片段，并使用Thermo Scientific的GeneJET Gel ExtractionKit回收DNA片段；

将pEarleyGate101为模板的扩增片段与pK2GW7酶切片段连接，得到PKCYFP，将pEarleyGate104为模板的扩增片段与pK2GW7酶切片段连接，得到PKNYFP；质粒提取后，测序。