[发明专利]Gateway克隆系统的植物表达载体及构建方法和应用

说明书

本发明属于生物技术和植物基因工程技术领域，公开了一种Gateway克隆系统的植物表达载体及构建方法和应用，所述Gateway克隆系统的植物表达载体分别为PKGMYC，PKNYFP和PKCYFP；PKGMYC的序列为SEQ ID NO：1；PKNYFP的序列为SEQ ID NO：2；PKCYFP的序列为SEQ ID NO：3。本发明以pK7GWIWG2D(II),0或pK2GW7为骨架，这两个载体分别使用SacI/KpnI和SacI/PmeI核酸内切酶进行双酶切；通过同源重组技术将其他Gateway系列载体构建入这两个载体，形成以卡那霉素为筛选标记的植物表达载体；同时，pK7GWIWG2D(II),0为骨架的改造载体还具有非融合的GFP荧光蛋白筛选标记。

技术领域

本发明属于生物技术和植物基因工程技术领域，尤其涉及一种Gateway克隆系统的植物表达载体及构建方法和应用。

背景技术

目前，最接近的现有技术：转基因技术自20世纪80年代初开始，逐步发展为一种在生物领域应用最广泛的基因研究方法，可通过农杆菌介导转化、花粉管通道法、基因枪法等技术将人工分离和修饰过的优质基因导入到植物基因组中，达到改造植物的目的。转基因技术可快速实现目标性状的改良，具有可用基因资源广、改良效率高等优点，为农作物产量及品质的提升、抗逆性的增强提供了新的路径。

基因载体作为基因导入细胞的工具，对转基因的成败起到决定性的作用。双元表达载体系统在植物基因工程中应用最为广泛，是指农杆菌中用于把T-DNA区域转入受体细胞的双质粒系统，其中一个质粒具有改造过的T-DNA区域，用于携带外源基因；另一个质粒带有毒性基因，用于T-DNA的转移。构建植物过表达载体可通过酶切连接的方式，如pCambia系列，pRI系列载体等，也可以通过Gateway技术构建载体，如pEarlygate等系列载体。选择合适的过表达载体，对于转基因的发展具有重要作用。选择过表达载体时通常需要考虑以下几个问题：1、载体的筛选标记，以便于转基因株系的筛选鉴定；2、启动外源基因的强弱，通常选用35s启动子、NOS(nopaline synthase)启动子、基因本身启动子等；3、是否有标签蛋白与过表达基因融合，便于过表达后蛋白水平的鉴定及后续实验，通常选用的标签蛋白有Myc、Flag、HA、GFP(Green Fluorescent Protein)、YFP(Yellow Fluorescent Protein)等。在转基因过程中，抗生素抗性基因是主要的筛选标记，通常在表达载体中具有表达某种抗生素的抗性基因，如卡那霉素(kana)抗性基因、Basta抗性基因、潮霉素抗性基因等。但是不同的植物对于不同的抗生素具有一定的敏感性，如苹果转基因通常采用卡那霉素作为筛选标记。另外，也可以通过一些荧光蛋白等作为筛选标记，如GFP。

Gateway技术利用位点特异重组，在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶，达到快速简便的构建各种表达载体。在一般使用的大肠杆菌中，如TOP10、DH5α等，gateway系列载体因具有ccdB毒性蛋白而将其杀死，因此，该系列载体只能在特定的大肠杆菌中复制，如DB3.1。Gateway技术可通过BP或LR反应将ccdB基因置换，保证构建成功的载体在TOP10、DH5α等大肠杆菌中正常复制，ccdB基因能够产生毒蛋白而无法使菌存活，而原始载体则因为ccdB基因的表达而使这些大肠杆菌致死。

综上所述，现有技术存在的问题是：pEarlygate系列载体由于其过表达能力强、利用Gateway技术快速简便的构建载体、具有标签蛋白等，广泛应用于拟南芥的遗传转化中。但是由于其筛选标记是Basta，无法应用于苹果的遗传转化。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种Gateway克隆系统的植物表达载体及构建方法和应用。