[发明专利]一种石油烃污染土壤中萘修复降解菌剂的制备方法

说明书

本发明公开了一种石油烃污染土壤中萘修复降解菌剂的制备方法，称取一定量石油烃污染土壤于培养基中培养，可得培养菌液；将培养菌液接种到无机盐培养基中，恒温振荡培养，利用梯度压力筛选进行驯化培养，培养后按梯度稀释加入生理盐水，平板涂布，于恒温培养箱中培养，挑取完整菌落于富集培养基中进行培养，可得富集培养菌液；将富集培养菌液接种至培养基中，恒温振荡培养至对数生长期，加入甘油混合后冷冻保存，即得萘修复降解菌剂。本发明萘修复降解菌株筛选分离方法相对简单，无二次污染，对石油烃污染土壤中萘的降解率高，通过生物强化过程实现对石油烃污染土壤中萘的高效修复，具有广阔的工程化应用前景。

技术领域

本发明涉及一种石油烃污染土壤中萘修复降解菌剂的制备方法，属于污染土壤微生物修复技术领域。

背景技术

萘是一种具有2环结构的稠环芳香烃，与多环芳烃类(PAHs)其它物质相比，具有低毒高效的特点，被广泛用于生产邻苯二甲酸酐、染料中间体、橡胶助剂、杀虫剂等。已有研究报道证实，萘暴露会导致溶血性贫血、肝脏和神经系统损伤、白内障和视网膜出血等危害影响。2017年10月，世界卫生组织国际癌症研究机构已将萘列入2B类致癌物清单中，我国也于2017年12月将其列入了第一批优先控制化学品名录。萘广泛存在于生态环境中，如地表水、地下水、土壤、沉积物等，在我国七大流域水体中均已检出较高浓度的萘。有研究表明，萘对水生生物具有极高毒性，可能对水体环境产生长期的不良影响。

近年来，我国土壤污染问题日益突出，土壤环境质量直接关系到农产品的安全，主要农产品中农药残留超标率高达16％～20％，土壤污染已成为限制我国农产品国际贸易和社会经济可持续发展的重要障碍之一，污染土壤修复和治理迫在眉睫。萘是土壤中常见的有机污染物，特别是在石油精炼、垃圾焚烧、焦化厂等场地，具有疏水性强、治理难度大等特点。目前，针对污染土壤中萘等PAHs的处理方法主要有化学淋洗、高级氧化、电动修复等，但普遍存在会破坏土壤团聚体，产生二次污染等不足。相比之下，微生物处理技术被认为是一种环境友好技术，具有快速、安全、费用低廉等优点，也是环境土壤中有机污染物得以转化和去除的主要过程。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种微生物处理石油烃污染土壤中萘的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种石油烃污染土壤中萘修复降解菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)：将石油烃污染土壤于LB培养基中培养，以活化土著微生物获得培养菌液；

步骤2)：将活化后的培养菌液接种到无机盐培养基中，置于恒温摇床中振荡培养，利用梯度压力筛选法进行驯化培养，培养后按梯度稀释加入生理盐水，将其平板涂布，置于恒温培养箱中培养；培养结束后，挑取尺寸均一且完整的菌落于固体培养基中进行富集培养；

步骤3)：将富集培养后的菌液接种至LB培养基中，置于恒温摇床中振荡培养至对数生长期，加入甘油混合后冷冻保存，即得萘修复降解菌剂。

优选地，所述步骤1)中石油烃污染土壤与LB培养基的比例为1g:(8～12)L，LB培养基的浓度为20～30g/L，培养的时间为24h。

优选地，所述步骤2)中活化后的培养菌液的接种量为5wt％；恒温摇床的温度为37℃，振荡速率为100～200r/min，振荡时间为4～7d；恒温培养箱的温度为37℃，培养时间为2-5d。