[发明专利]一种利用培养基进行胚胎质量的检测方法有效

专利信息
申请号: 201911063474.X 申请日: 2019-10-31
公开(公告)号: CN110684721B 公开(公告)日: 2021-08-03
发明(设计)人: 曾勇;姚志鸿;熊风;孙青;李观贵;陈培林;钟惠娴;万才云;彭晓琪;周灿权 申请(专利权)人: 深圳中山泌尿外科医院
主分类号: C12N5/073 分类号: C12N5/073;G01N33/68
代理公司: 北京轻创知识产权代理有限公司 11212 代理人: 厉洋洋
地址: 518000 广东*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 一种 利用 培养基 进行 胚胎 质量 检测 方法
【权利要求书】:

1.一种利用培养基进行胚胎质量的检测方法,所述培养基包括胎牛血清蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂和嘌呤霉素,所述胎牛血清蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂和嘌呤霉素的质量比为1979:20:1;所述胎牛血清蛋白的浓度为10%g/dl,所述胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂的浓度为1%g/dl,所述嘌呤霉素的浓度为500ng/mL,其特征在于,包括以下步骤:

A、胚胎培养与胚胎条件培养液的收集:取囊胚培养液微滴,取受精卵采用序贯培养液进行胚胎培养得到胚胎,所述胚胎在胚胎培养2天后按照10:(1~2)的体积比添加所述囊胚培养液微滴培养3天,得到胚胎条件培养液并于-70~-80℃下保藏3~10天;

B、解冻子宫内膜基质细胞:将冷冻于液氮罐中的子宫内膜基质细胞于34~40℃下解冻后按照1:(3~5)的体积比加入所述培养基,接着在1000~1200r/min的转速下离心2~4min,弃去上清液后加入1ml所述培养基,重悬培养液得到重悬细胞液;

C、培养子宫内膜基质细胞:将步骤B中的重悬细胞液加入4.5~5.5ml所述培养基,然后将重悬细胞液中的细胞按照十字混匀法均匀铺开,接着在37℃和5%CO2的培养箱中孕育4~6个小时,再然后弃去培养液且用PBS冲洗后加入4.5~5.5ml所述培养基,再接着放入到37℃和5%CO2的培养箱中孕育2~3天后用胰蛋白酶进行消化,并培养于48孔细胞培养板中,所述48孔细胞培养板中每孔细胞数为5×104个,置于37℃和5%CO2的培养箱中培养至培养板中细胞汇合度达到90%以上,更换为胎牛血清蛋白含量为2%的完全培养液;

D、添加胚胎条件培养液:将步骤C中的所述完全培养液弃去,用PBS冲洗1~2次后每个孔均加入179~180μL的所述培养基和18~22μL的步骤A中的胚胎条件培养液得到混合液,接着静置46~49h后收集所述混合液中的细胞上清液即得到子宫内膜细胞分泌蛋白;

E、蛋白检测:将步骤D中的细胞上清液采用激光扫描仪InnoScan 300扫描信号,得到子宫内膜细胞分泌蛋白的差异蛋白从而判断胚胎质量,所述差异蛋白为IL-6。

2.根据权利要求1所述的胚胎质量的检测方法,其特征在于, 所述囊胚培养液微滴的制备方法为在培养皿中滴入25~30μl的培养液,接着在培养液中添加细胞培养油至细胞培养油覆盖所述培养液,静置1天得到。

3.根据权利要求1所述的胚胎质量的评估方法,其特征在于,取受精卵采用序贯培养液进行胚胎培养的具体步骤为:在静置培养的第一天,受精卵采用受精卵培养基,静置培养的第二天至第三天,受精卵采用卵裂期胚胎培养液,静置培养的第四天至第五天,受精卵采用囊胚培养液。

4.根据权利要求1所述的胚胎质量的检测方法,其特征在于,在步骤A中,所述胚胎在胚胎培养2天后于25~30μl囊胚培养液微滴中培养3天。

5.根据权利要求1所述的胚胎质量的检测方法,其特征在于,在步骤B中,将子宫内膜基质细胞于37℃下解冻后按照1:4的体积比加入所述培养基,接着在1000r/min的转速下离心3min,弃去上清液后加入1ml所述培养基得到重悬细胞液。

6.根据权利要求1所述的胚胎质量的检测方法,其特征在于,在步骤C中,将步骤B中的重悬细胞液按照1:4的体积比加入培养基,在37℃和5%CO2的培养箱中孕育6个小时。

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