[发明专利]一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法

权利要求书

1.一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法，其特征在于，以生物样品中特异性核酸片段为研究对象，制备生物样品的核酸靶标、猝灭荧光探针、Cas12g三元复合体；将Cas12g三元复合体、核酸靶标、猝灭荧光探针、背景RNA和RNA酶抑制剂混合在核酸酶缓冲液中孵育，当Cas12g三元复合体与核酸靶标识别匹配后，不仅剪切核酸靶标，且附带非特异性反式剪切猝灭荧光探针，进而获取可被检测的荧光；通过采集荧光光谱数据，构建上转换纳米荧光强度变化值与不同浓度的核酸靶标的定量检测模型，实现生物样品中核酸靶标的纳米荧光痕量快速检测。

2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法，其特征在于，所述核酸靶标的制备方法为：若生物样品为DNA则提取方法为：经过RPA扩增和体外转录可获得靶标；若生物样品为RNA则提取方法为：经过RT-RPA扩增和体外转录进而得到靶标。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法，其特征在于，所述猝灭荧光探针的荧光基团采用上转换纳米颗粒UCNP_S，猝灭基团使用非荧光猝灭剂QC-1，所述荧光基团和猝灭基团之间用单链DNA或RNA连接，最终得到猝灭荧光探针QC-1-RNA/DNA-UCNP_S。

4.根据权利要求3所述的一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法，其特征在于，所述上转换纳米颗粒采用高温热分解法合成，过程为：以稀土结晶水合物氯化盐等为原料，油酸和1-十八烯为溶剂，搭建基于稀土元素掺杂的高温热分解法UCNPs合成平台，制备出粒径大小约为50nm的油相OA-UCNPs，在其表面修饰氨基转为水溶性的NH₂-UCNPs。

5.根据权利要求4所述的一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法，其特征在于，所述Cas12g三元复合体包括Cas12g、crRNA和tracrRNA，所述crRNA和tracrRNA可进行共折叠，crRNA的N区域为可变间隔序列区，且可变间隔序列区与核酸靶标序列互补。

6.根据权利要求5所述的一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法，其特征在于，所述Cas12g的制备方法：

S1，构建Cas12g蛋白表达质粒。合成Cas12g基因，在Cas12g基因序列两端分别加上BamHI和Xho I酶切位点；用BamH I和Xho I双酶切处理pET28a质粒；将加上BamH I和Xho I酶切位点的Cas12g与酶切后的pET28a质粒连接，得到Cas12g蛋白表达质粒，即pET28a-Cas12g；

S2，将Cas12g蛋白表达质粒转化至感受态细胞，涂平板培养过夜，挑选单菌落扩大培养，待菌液OD600为1～1.5时，用0.2mM IPTG诱导蛋白表达，培养过夜后离心收集培养物，裂解缓冲液+蛋白酶抑制剂进行重悬；超声破碎细胞，4℃条件下28000xg离心20min，将上清液加到HisTrap FF柱上，通过FPLC经50mM～500mM的咪唑梯度纯化；SDS-PAGE凝胶电泳后再浓缩，透析获得Cas12g蛋白。