[发明专利]一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法：以生物样品中特异性核酸片段为研究对象，制备生物样品的核酸靶标、猝灭荧光探针、Cas12g三元复合体；将Cas12g三元复合体、核酸靶标、猝灭荧光探针、背景RNA和RNA酶抑制剂混合在核酸酶缓冲液中孵育，当Cas12g三元复合体与核酸靶标识别匹配后，不仅剪切核酸靶标，且附带非特异性反式剪切猝灭荧光探针，进而获取可被检测的荧光；通过采集荧光光谱数据，构建上转换纳米荧光强度变化值与不同浓度的核酸靶标的定量检测模型，实现生物样品中核酸靶标的纳米荧光痕量快速检测。本发明能够适用于生物样品中特异性核酸片段快速、特异、灵敏的检测方法。

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，尤其是一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法。

背景技术

伴随着核酸检测技术的快速发展，各种生物样品的快速检测方法相继出现。如致使食源性疾病的食源性致病菌，已成为世界食品安全的热点问题。近年来，国内外的生物恐怖主义威胁以及食源性疾病事件引发人们对食源性致病菌的高度关注。对生物样品中食源性致病菌特异性核酸片段的快速检测是预防食源性疾病的重要手段。

目前，核酸检测技术包括基于PCR的检测技术(普通PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR和实时定量反转录PCR等)和非PCR核酸检测技术(环介导等温扩增、核酸依赖性扩增检测技术、基因芯片和微流体芯片等)。这些检测方法虽各有优势，但存在检测周期长或检测费用高或易出现假阳性和假阴性结果等缺陷。因此，迫切需要一种快速、特异、灵敏的适用于生物样品中特异性核酸片段的检测方法。国内外尚未有采用CRISPR-Cas12g系统实现生物样品中特异性核酸片段的纳米荧光定量检测方面的报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提出了一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法，能够适用于生物样品中特异性核酸片段快速、特异、灵敏的检测方法。

本发明所采用的技术方案如下：

一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法：

以生物样品中特异性核酸片段为研究对象，制备生物样品的核酸靶标、猝灭荧光探针、Cas12g三元复合体；将Cas12g三元复合体、核酸靶标、猝灭荧光探针、背景RNA和RNA酶抑制剂混合在核酸酶缓冲液中孵育，当Cas12g三元复合体与核酸靶标识别匹配后，不仅剪切核酸靶标，且附带非特异性反式剪切猝灭荧光探针，进而获取可被检测的荧光；通过采集荧光光谱数据，构建上转换纳米荧光强度变化值与不同浓度的核酸靶标(生物样品特异性核酸片段)的定量检测模型，实现生物样品中核酸靶标(特异性核酸片段)的纳米荧光痕量快速检测。

进一步，所述核酸靶标的制备方法为：若生物样品为DNA则提取方法为：经过RPA扩增和体外转录可获得靶标；若生物样品为RNA则提取方法为：经过RT-RPA扩增和体外转录进而得到靶标；

进一步，所述猝灭荧光探针的荧光基团采用上转换纳米颗粒(UCNP_S)，猝灭基团使用水溶性非荧光猝灭剂QC-1，该淬灭剂能够将一定距离内荧光基团发出的光吸收，拥有较宽的吸收光谱范围(～500nm到～900nm),猝灭效率高(97％)；所述荧光基团和猝灭基团之间用单链DNA或RNA连接，最终得到猝灭荧光探针QC-1-RNA/DNA-UCNP_S。所述猝灭荧光探针拥有信号报告功能，当猝灭荧光探针中的单链RNA或单链DNA被激活的Cas12g蛋白附带切割时，其中的UCNP_S发出可被检测的荧光。且上转换纳米颗粒(UCNP_S)的光化学性质稳定、基本不受外界环境影响、检测背景低、装置简单以及成本低。