[发明专利]一种金属硫蛋白融合蛋白构建、固定化载体快速制备及其在重金属离子去除中的应用

说明书

本发明提供了一种金属硫蛋白融合蛋白构建、固定化载体快速制备及其在重金属离子去除中的应用。采用基因工程的方法，将金属硫蛋白、碳水化合物结合结构域以及超折叠绿色荧光蛋白的编码基因相融合得到融合基因mt‑cbm‑sfGFP。将以上融合基因构建表达载体并转化到大肠杆菌表达宿主中进行表达。将表达得到的蛋白固定到不可溶的碳水化合物载体上，进一步将上述结合有金属硫蛋白的水不溶碳水化合物颗粒应用于中药金银花水煎液中的重金属离子的去除。结果表明可快速有效地去除铅离子，且不影响金银花水煎液中的主要活性成分。本发明的方法具有成本低、快速方便、可视化的优点，可用于中药水煎液、液体食品、废水中重金属的快速有效去除。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种金属硫蛋白融合蛋白构建、固定化载体快速制备及其在重金属离子去除中的应用。

背景技术

目前中国大约有12000种药用植物，在疾病预防治疗和保健养生中普遍应用。然而，中药材产品重金属超标问题不容忽视。重金属离子通过与人体内酶蛋白上的-SH和-S-S键牢固结合，从而使蛋白质变性，导致组织细胞出现结构和功能上的损害，对人体健康和公共卫生构成了严重的威胁。2015版《中华人民共和国药典》分别对黄芪、海藻、丹参等在内的11种植物药，牡蛎、阿胶、蜂等在内的10种动物药和滑石粉、冰片等在内的6种矿物药制订了重金属限量值。

针对中药材重金属污染的治理主要从土壤修复和针对中药材加工两方面着手。土壤修复包括客土法、物理修复、化学修复、植物修复和微生物修复等途径。其中微生物修复技术较物理化学方法相比，可以减少二次污染，且微生物在土壤中的自我繁殖可以保证长时间的处理以达到预期效果。但是，土壤污染的治理周期非常长且同一时段无法大范围开展，否则将会严重影响经济的可持续发展。因此，在进行土壤修复的同时还可以处理受污染中草药以减轻重金属对人体的危害。中草药在临床上应用最早最广泛的剂型即是汤剂，为药材加水煎煮一定时间后去渣取汁而成。在煎煮过程中，富集在中草药中的重金属会因蛋白质在高温下变性而游离至水煎液中。寻找一种既可以减轻重金属对人体的危害还能避免受污染中药资源浪费的方法具有非常重要的研究意义。

金属硫蛋白( metallothionein，MT) 是一类广泛存在于生物中的低分子质量（6～7 kD）、无芳香族氨基酸、富含金属与半胱氨酸（20%～30%）的独特生物学特性的金属结合蛋白。金属硫蛋白中大量巯基赋予了其螯合重金属离子功能。利用这一特性,金属硫蛋白不仅可作为衡量重金属污染状况的一个生物指标，还可用于重金属的回收和清除等方面。目前主要通过基因工程改造的含有金属硫蛋白编码基因的微生物来治理重金属污染。但是将全细胞生物应用在污水等复杂环境时，不仅全细胞生物会受到pH、温度、含氧量等诸多因素的影响，而且难以从环境中分离开来。例如，Gupta等将可过度表达金属结合蛋白和金属硫蛋白的大肠杆菌以藻酸钙生物珠包裹用以治理污水中的铜和镉污染（Dipinte Gupta,Suresh Satpati, Anshuman Dixit, Rajiv Ranjan. Applied Microbiology andBiotechnology, 2019, 103: 5411-5420），虽然上述方法可以从污水中分离出吸附重金属的生物珠，但生物珠颗粒大，比表面积相对较小。此外，目前金属硫蛋白治理重金属污染的应用领域主要集中在土壤、海水、废水、作物、食品中，而对中药材，特别是中药材制剂还未涉及。此外，由于金属硫蛋白富含半胱氨酸，且对宿主细胞中的金属离子有重要的调控作用，其在大肠杆菌、芽孢杆菌以及酵母等宿主细胞中表达量很低，或者以无活性的包涵体的形式存在。