[发明专利]基于人突变蛋白为基础的GDH抑制剂高通量筛选方法

权利要求书

1.一种基于人突变蛋白为基础的GDH抑制剂高通量筛选方法，其特征是：包括以下步骤，

步骤一，突变基因的质粒构建和制备携带突变基因质粒的逆转录病毒，该质粒装有红色荧光蛋白；

步骤二，细胞转染：在培养基中加入携带了突变基因质粒的逆转录病毒，转染后细胞继续培养72到96小时，在荧光显微镜下判断红色荧光蛋白阳性细胞比率，从而确定转染及突变基因表达效率，达到60%以上，就收取细胞，冻存在-80℃冰箱；

步骤三，酶学检测：冻存细胞化冻后，加入细胞裂解液，匀浆破损细胞，确定蛋白含量，之后用0.1 M 磷酸缓冲液将裂解液的蛋白稀释，随后待筛选的化合物经系列稀释后加入反应体系中，所述反应体系中包括谷氨酸和NAD+，酶学反应是基于如下反应：

谷氨酸 + NAD⁺ àalpha-酮戊二酸 + NH4⁺+ NADH

绘制GDH活性抑制曲线，若待筛选化合物能使GDH抑制曲线左移，则表明该化合物具有抑制GDH的活性。

2.根据权利要求1所述的基于人突变蛋白为基础的GDH抑制剂高通量筛选方法，其特征是：步骤三中，酶反应在0.1 M，pH 7.5的磷酸缓冲液中进行，NAD+ 浓度为0.2 mM，谷氨酸钠的浓度为50 mM， 加入反应的细胞裂解液的蛋白浓度为1 mg/mL，每个反应添加5 ul，所有反应溶液都在实验当日新鲜配置，酶反应用酶标仪读数，测定反应波长为340 nm，反应在384孔板中进行，反应体系总容量是25 ul。

3.根据权利要求2所述的基于人突变蛋白为基础的GDH抑制剂高通量筛选方法，其特征是：步骤三中，待筛选的化合物经系列稀释后加入反应体系中，每个待筛选化合物都从最高浓度稀释，按照每次稀释1倍，共稀释11次。

4.根据权利要求1所述的基于人突变蛋白为基础的GDH抑制剂高通量筛选方法，其特征是：0.1 M 磷酸缓冲液为pH 7.0，并加入 1 mM EDTA。

5.根据权利要求1所述的基于人突变蛋白为基础的GDH抑制剂高通量筛选方法，其特征是：所述待筛选化合物在反应体系中的浓度范围为～mol/L。

6.根据权利要求1所述的基于人突变蛋白为基础的GDH抑制剂高通量筛选方法，其特征是：步骤二中细胞转染中用到的细胞为239T细胞。

7.根据权利要求1所述的基于人突变蛋白为基础的GDH抑制剂高通量筛选方法，其特征是：步骤一中突变基因的质粒构建，首先用标准分子生物学的方法做GDH基因的点突变，GDH基因的点突变用从先天性高胰岛素血症病人身上发现的突变蛋白为筛选模板。

8.根据权利要求7所述的基于人突变蛋白为基础的GDH抑制剂高通量筛选方法，其特征是：GDH基因的点突变分别为H454Y、S445L、R221L、V453M和R269H的五个点位的基因突变。