[发明专利]基于人突变蛋白为基础的GDH抑制剂高通量筛选方法

说明书

本发明公开了一种基于人突变蛋白为基础的GDH抑制剂高通量筛选方法，达到筛选的抑制剂接近生理状态，涉及药物筛选技术领域，其技术方案要点是：包括以下步骤，步骤一，突变基因的质粒构建和制备携带突变基因质粒的逆转录病毒，该质粒装有红色荧光蛋白；步骤二，细胞转染：步骤三，酶学检测：绘制GDH活性抑制曲线，若待筛选化合物能使GDH抑制曲线左移，则表明该化合物具有抑制GDH的活性。

技术领域

本发明涉及药物筛选技术领域,更具体地说，它涉及一种基于人突变蛋白为基础的GDH抑制剂高通量筛选方法。

背景技术

新生儿低血糖是威胁新生儿健康甚至生命的严重疾病，反复发作的严重低血糖不仅威胁生命也能造成永久且不可逆的脑功能伤害，发生脑功能损害的比例高达60%～70%，终身致残，给家庭和社会都带来严重的伤害和负担。因为引起低血糖的原因复杂（已经发现了至少11个致病基因），主要致病基因包括：氨基酸代谢关键酶，谷氨酸脱氢酶（GDH）获得功能突变等。

谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase,GDH）是氨基酸代谢的关键酶，GDH获得功能突变是新生儿低血糖的一个亚型，病人不仅有低血糖，还有肝肾功能损害造成的高氨血症及脑功能损害造成的癫痫和脑发育延迟，学习能力障碍等，是一个全身的系统性疾病，目前仅仅用二氮嗪控制低血糖，对脑功能障碍及肝肾损害没有任何治疗办法，所以急需要一个针对突变GDH的全身性的抑制剂。

目前，高通量筛选是当前创新药物发现的重要模式，GDH抑制剂的研发需要在化合物库中通过高通量药物筛选的办法找到GDH酶的抑制剂。目前的筛选办法是基于牛肝脏GDH为基础的，由于是基于牛肝脏GDH为基础的，因此细胞内表达的GDH无法保持了人体细胞内的微环境，无法具备完整的相关蛋白调节及小分子变构调节的环境，最终导致筛选体系无法接近生理状态。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于人突变蛋白为基础的GDH抑制剂高通量筛选方法，达到筛选的抑制剂接近生理状态。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种基于人突变蛋白为基础的GDH抑制剂高通量筛选方法，包括以下步骤，

步骤一，突变基因的质粒构建和制备携带突变基因质粒的逆转录病毒，该质粒装有红色荧光蛋白；

步骤二，细胞转染：在培养基中加入携带了突变基因质粒的逆转录病毒，转染后细胞继续培养72到96小时，在荧光显微镜下判断红色荧光蛋白阳性细胞比率，从而确定转染及突变基因表达效率，达到60%以上，就收取细胞，冻存在-80℃冰箱；

步骤三，酶学检测：冻存细胞化冻后，加入细胞裂解液，匀浆破损细胞，确定蛋白含量，之后用0.1 M 磷酸缓冲液将裂解液的蛋白稀释，随后待筛选的化合物经系列稀释后加入反应体系中，所述反应体系中包括谷氨酸和NAD+，酶学反应是基于如下反应：

谷氨酸 + NAD⁺ àalpha-酮戊二酸 + NH4⁺+ NADH

绘制GDH活性抑制曲线，若待筛选化合物能使GDH抑制曲线左移，则表明该化合物具有抑制GDH的活性。

通过采用上述技术方案，该质粒装有红色荧光蛋白可以直接检验细胞转染的效率，在培养基中加入携带了突变基因质粒的逆转录病毒，转染后细胞继续培养72到96小时，在荧光显微镜下判断红色荧光蛋白阳性细胞比率，从而确定转染及突变基因表达效率，GTP是GDH的天然细胞内抑制剂，突变GDH获得功能的特点表现为对GTP的敏感性降低，抑制曲线明显右移，在酶学检测中，待筛选化合物能使GDH抑制曲线左移，提示以上化合物具有抑制GDH的活性，细胞内表达的GDH保持了细胞内的微环境，具备完整的相关蛋白调节及小分子变构调节的环境，筛选体系更接近生理状态，此外突变基因的质粒构建为从在先天性高胰岛素血症病人中发现的GDH突变，用从病人身上发现的突变蛋白为筛选模板，筛选的抑制剂有直接的临床指导意义。