[发明专利]一种降解产物均一的琼胶酶及其应用

说明书

本发明公开了一种降解产物均一的琼胶酶及其应用，属于酶工程领域。本发明将类芽孢杆菌(Paenibacillus odorifer)来源的琼胶酶AgaP1(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)在大肠杆菌中异源表达，其中粗酶液中琼脂糖和琼脂粉为底物的酶活分别为5716.68U/L和4116.96U/L。纯化得到的琼胶酶AgaP1纯酶液能够降解琼脂糖得到单一降解产物新琼二糖，是一种具有工业应用前景的琼胶酶。

技术领域

本发明涉及一种降解产物均一的琼胶酶及其应用，属于酶工程领域。

背景技术

琼胶又名琼脂，是从石花菜、江蓠等红藻提取出的多糖，属于三大海藻胶之一。它的主要组成成分是琼脂糖和琼脂胶，琼脂糖是由1,3糖苷键连接的β-D-半乳糖(G)和由1,4糖苷键连接的3,6-内醚-α-L-半乳糖(LA)残基重复交替连接成的线性多糖分子，不含硫酸酯(盐)的非离子型多糖，是形成凝胶的组分。琼脂胶的结构是在交联的半乳糖糖链上常含有D-半乳糖、3,6-半乳糖苷、半乳糖醛酸以及硫酸基、羧酸、丙酮酸等电荷基团，并结合着钙、镁等无机元素。

琼胶酶是指能够降解琼胶，产生琼胶寡糖的一类糖苷水解酶，主要来源于海洋细菌，少部分来源于陆生环境中的细菌以及海洋软体动物。根据琼胶酶降解糖苷键和产物的不同，琼胶酶可以分成α-琼胶酶和β-琼胶酶。α-琼胶酶作用于琼脂糖的α-1,3糖苷键，生成琼寡糖；β-琼胶酶作用于β-1,4糖苷键，降解产物为新琼寡糖。β-琼胶酶降解所产生的新琼二糖对肠道菌群的生长还具有显著的益生元效应，也可以通过抑制黑色素的合成达到美白效果。

运用酸解法和酶解法制备琼脂寡糖都会出现产物不均一的问题，而因为寡糖自身的理化性质接近，得到单一组分需要进行分离纯化，导致产率低成本高，阻碍了其高值化应用。因此，发现一种可特异性降解琼胶产生的单一寡糖成分的β-琼胶酶具有重要的应用意义。但是，目前报道的β-琼胶酶酶解产物成分复杂，通常包含有新琼二糖、四糖和六糖。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种降解产物均一的琼胶酶，含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码上述琼胶酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，上述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供含上述基因的质粒或载体。

本发明的第四个目的是提供表达上述琼胶酶的细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞的宿主包括并不限于大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞的宿主包括并不限于大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞是以pColdII为表达载体。

本发明的第五个目的是提供一种产琼脂酶的方法，是先在大肠杆菌中表达上述琼脂酶，得到表达上述琼脂酶的基因工程菌，再应用该基因工程菌进行发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的培养基为LB培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为将基因工程菌E.coli BL21-pColdII-AgaP1接种于LB培养基中，35-39℃，200-220rmp培养10-15h得到种子液，然后按1％-10％的接种量(V/V)将上述种子液接种于LB培养基中，35-39℃培养至OD₆₀₀为0.4-0.6，以终浓度为0.2-0.5mM的IPTG作为诱导剂，于12-18℃，200-220rmp培养20-30h。。

本发明的第六个目的是提供一种产新琼二糖的方法，是以琼脂糖底物，添加含上述琼脂酶的粗酶液或表达上述琼脂酶的细胞，进行降解反应。