[发明专利]一种慢病毒载体介导SV40 T抗原转染获得永生化细胞株的方法

权利要求书

1.一种构建永生化细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建SV-40T抗原慢病毒表达载体：

以含SV40 T抗原cDNA序列的SV40 tsA58质粒为模板，根据NCBI的SV40完整基因组(NC_001669.1)设计特定的质粒构建引物，高保真PCR获取SV40T抗原全长cDNA，对扩增得到PCR产物进行纯化；

将PCR产物TOPO克隆进入pENTR^TMTOPO载体，获得pENTR-SV40 T质粒；

LR重组反应将pENTR-SV40 T质粒中的SV40 T抗原cDNA克隆到目标慢病毒载体，构建SV40 T抗原慢病毒表达载体pLenti4/V5-GW/SV40 T，

2)慢病毒包装：

采用脂质体Lipofectamine^TM2000介导pLenti4/V5-SV40 T和包装质粒pCMV-VSV-G及psPAX2转染工程细胞293FT，进行假病毒包装，

3)慢病毒介导SV40 T抗原转染原代分离细胞获得永生化细胞株：

分离和原代培养待永生化细胞，用含SV40 T抗原的轮替病毒培养上清液转染原代培养细胞，以博来霉素抗性特点筛选转染和稳定表达SV40 T抗原的原代培养细胞，获得永生化细胞株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述构建引物包括具有SEQ IDNo.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQID No.2所示核苷酸序列的下游引物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中高保真PCR的体系为：引物混合液1.5μL，10×Pfu DNA聚合酶反应混合物(含dNTPs)5μL，Pfu DNA聚合酶0.5μL，模板DNA质粒1μL，用灭菌去离子水补齐到50μL；反应程序为：95℃2min；95℃15s，58℃30s，68℃4min，36个循环；68℃5min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，利用以M13正向和逆向引物对pENTR-SV40 T质粒进行PCR扩增，并通过对PCR产物进行测序对所述pENTR-SV40 T质粒进行鉴定。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述LR重组反应具体包括：1.5mL离心管中加入7μL所述pENTR-SV40 T质粒、1μL目标慢病毒载体pLenti4/V5-DEST、8μLTE缓冲液、2μL LR Clonase^TMII enzyme mix，混匀，25℃孵育1h，加入1μL蛋白酶K溶液终止反应，反应液混匀后37℃孵育10min。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，进一步包括以下步骤：转化1μL所述反应液于50μL Stbl3^TM感受态细胞，冰上孵育30min，42℃热休克30秒，加入250μL S.O.C.培养液，37℃振摇培养1h，分别将20μL和100μL转化液铺于氨苄青霉素LB琼脂板。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述待永生化细胞为肝星状细胞。

8.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，进一步包括对获得的永生化细胞株进行鉴定的步骤。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述鉴定包括生物学特征鉴定、细胞株的可传代性鉴定、细胞株SV40 T抗原表达检测。

10.一种永生化细胞株，其特征在于，所述永生化细胞株是利用权利1-6任一所述的方法得到的。