[发明专利]一种慢病毒载体介导SV40 T抗原转染获得永生化细胞株的方法

说明书

本发明公开了一种慢病毒载体介导SV40 T抗原转染获得永生化细胞株的方法，属于细胞生物学领域。具体地，本发明通过构建一种能够高效、快速转染的SV40 T抗原慢病毒表达载体，该载体通过工程细胞包装可获得表达SV40 T抗原的慢病毒颗粒用于转染原代分离细胞，进而通过博来霉素（zeocin）抗性特点筛选获得永生化细胞株。本发明公开的构建永生化细胞株的方法具有高效、方便、快捷的特点，并且价格低廉，适于推广应用。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体地，涉及一种慢病毒载体介导SV40 T抗原转染获得永生化细胞株的方法。

背景技术

细胞生物学研究中多数原代分离细胞作为终末分化的细胞在体外的培养和传代时间有限，传代一定次数后就会进入衰老期而不能再继续增殖。而反复分离原代细胞不仅费时费力，而且各批次细胞间存在差异，不能保持细胞生理指标的稳定性。

一些抑癌基因P53和pRB的失活以及端粒酶的激活，是人体细胞获得永生化的必要条件。哺乳动物细胞使用几种方法诱导细胞永生化(Cell immortalizing)，其中包括使用猿猴病毒40(Simian virus 40，SV40)T抗原基因、人类端粒酶逆转录酶基因、P53和pRB的shRNAs等。SV40大T抗原是由SV40病毒早期编码区编码的一种多功能磷酸蛋白，在病毒复制过程中发挥着重要作用。SV40大T抗原具有活化宿主细胞核糖体基因、诱导DNA合成、修饰蛋白质合成起始因子等作用，并且能结合、调控某些关键性的细胞调控蛋白，如视网膜母细胞瘤蛋白家族成员(如pRB)、肿瘤抑制因子p53等，并可诱导感染细胞的端粒酶活性，诱导多种细胞的永生化。通过对SV40大T抗原介导的永生化细胞系的深入研究发现：SV40大T抗原基因与宿主细胞DNA稳定整合重组后，不但能在细胞内表达SV40大T抗原，加快转化细胞的生长速率，同时也能保留原始细胞的许多分化表型，具有相对稳定的增殖特性和功能状态，而在转化细胞系中非原始基因的表达很少见。

目前，已有一些方法用于介导SV40大T抗原基因的转染，如通过脂质体介导构建有SV40大T抗原基因的真核表达质粒载体转染目标原代细胞并筛选获得永生化细胞系的方法，但其转染效率较低，筛选困难，一些较难转染的细胞难以获得稳定表达和建立细胞系。另有一些构建的腺病毒或慢病毒SV40 T表达载体在转染后缺少简便的筛选方法，如需要特殊温度控制的培养箱培养筛选。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种构建永生化细胞株的方法，为了达到这个目的，本发明构建一种能够高效、快速转染的SV40 T抗原慢病毒表达载体，该载体通过工程细胞包装可获得表达SV40 T抗原的慢病毒颗粒(假病毒)用于转染原代分离细胞，进而通过博来霉素(zeocin)抗性特点筛选获得永生化细胞株。

本发明所采用的技术方案如下：

1.构建SV-40 T抗原慢病毒表达载体：

(1)以含SV40 T抗原cDNA序列的SV40 tsA58质粒为模板，根据NCBI的SV 40完整基因组(NC_001669.1)设计特定的质粒构建引物，高保真PCR获取SV40 T抗原全长cDNA，对扩增得到PCR产物进行纯化。

在本发明的一些实施方案中，所述构建引物包括具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的下游引物。

在本发明的一些实施方案中，高保真PCR的体系为：引物混合液1.5μL，10×PfuDNA聚合酶反应混合物(含dNTPs)5μL，Pfu DNA聚合酶0.5μL，模板DNA质粒1μL，用灭菌去离子水补齐到50μL。

在本发明的一些实施方案中，高保真PCR的反应程序为：95℃2min；95℃15s，58℃30s，68℃4min，36个循环；68℃5min。