[发明专利]一种特异靶向小鼠Idua基因的sgRNA导向序列及其应用

权利要求书

1.一种特异靶向小鼠Idua基因的sgRNA导向核苷酸片段，其特征在于，所述sgRNA对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3中的任意一种序列。

2.一种利用权利要求1所述的特异靶向小鼠Idua基因的sgRNA导向序列编辑小鼠Idua基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：在权利要求1所述的特异靶向小鼠Idua基因的sgRNA导向序列的5'端加上accg合成得到正向寡核苷酸序列；

同时根据权利要求1所述的特异靶向小鼠Idua基因的sgRNA导向序列获得其对应的DNA互补链，并且在DNA互补链的5'端加上aaac合成得到反向寡核苷酸序列；

将正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列退火，形成具有粘性末端的双链DNA片段；

步骤2：利用Bsa I限制性内切酶酶切SEQ ID NO.4所示的目标载体pGL3-U6-sgRNA质粒，得到酶切产物pGL3-U6-sgRNA-Bsa I；

步骤3：将步骤1得到的具有粘性末端的双链DNA片段和步骤2得到的酶切产物pGL3-U6-sgRNA-Bsa I连接，将连接产物转化感受态大肠杆菌并涂布于氨苄抗性的LB培养基上，37℃过夜培养20h后，挑取单克隆并用SEQ ID NO.5所示的通用引物U6通过测序鉴定出阳性克隆，对阳性克隆摇菌、提取质粒，得到pGL3-U6-Idua-sgRNA质粒；

步骤4：将步骤3得到的pGL3-U6-Idua-sgRNA质粒和SEQ ID NO.6所示的pST1374-NLS-flag-l inker-Cas9表达质粒，共转染小鼠N2a细胞，经药物筛选后，得到阳性的sgRNA-Cas9共转染细胞；

步骤5：将步骤4得到的阳性的sgRNA-Cas9共转染细胞进行细胞裂解，以得到细胞裂解液为模板进行打靶位点DNA的PCR扩增反应，取打靶位点DNA的PCR扩增产物进行Sanger测序，如果打靶位点出现套峰，则初步确认发生了基因编辑；

步骤6：TA克隆测序分析步骤5初步确认发生了基因编辑的打靶位点的基因型，并获得基因编辑后的小鼠细胞。

3.根据权利要求2所述的编辑小鼠Idua基因的方法，其特征在于，步骤1中，所述退火的反应体系具体为：10μM正向寡核苷酸，5μL；10μM反向寡核苷酸，5μL；10×T7 EndonucleaseI buffer，2μL；ddH₂O，8μL；反应程序具体为：95℃，5min；95℃到85℃，-1℃/循环，共10个循环；85℃到25℃，-0.1℃/循环，共600个循环，退火产物-20℃保存。

4.根据权利要求2所述的编辑小鼠Idua基因的方法，其特征在于，步骤2中，所述酶切的反应体系具体为：pGL3-U6-sgRNA质粒，2μg；10×酶切buffer，2μL；Bsa I限制性内切酶，2μL；补充ddH₂O至总体积20μL，将酶切反应体系置于37℃反应3h。

5.根据权利要求2所述的编辑小鼠Idua基因的方法，其特征在于，步骤3中，所述转化感受态大肠杆菌的具体方法为：取5μL连接产物快速加入到30μL感受态大肠杆菌中，充分混匀，冰上静置25min，42℃水浴热激90s，冰上冷却2min，加入150μL的LB液体培养基，转速为220转/min，37℃活化30min，然后涂布于氨苄抗性的LB培养基表面；所述具有氨苄抗性的LB培养基中，氨苄青霉素的浓度为50μg/mL；所述摇菌的温度为37℃，转速为220转/min，涂布于培养基上后，倒置过夜培养；所述提取质粒采用去内毒素质粒中提试剂盒。