[发明专利]一种特异靶向小鼠Idua基因的sgRNA导向序列及其应用

说明书

本发明公开了一种特异靶向小鼠Idua基因的sgRNA导向序列及其应用，属于医学遗传学和分子生物学技术领域。所述sgRNA对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3中的任意一种序列。本发明还公开了利用上述的特异靶向小鼠Idua基因的sgRNA导向序列编辑小鼠Idua基因的方法。本发明的sgRNA导向序列可以介导Cas9蛋白，高效地切割靶点DNA，进而用于编辑小鼠Idua基因，影响小鼠Idua基因编码蛋白的功能。本发明的sgRNA导向序列可以通过CRISPR/Cas9系统实现高效打靶，效率分别为100％、83.33％和100％。

技术领域

本发明涉及一种特异靶向小鼠Idua基因的sgRNA导向序列及其应用，属于医学遗传学和分子生物学技术领域。

背景技术

CRISPR/Cas系统最早在细菌中被发现，其在真细菌和古细菌中行使获得性免疫功能，可抵抗外源病毒和质粒入侵。人们通过基因工程手段对微生物自身生物的CRISPR/Cas系统进行改造，从而创造了可广泛应用于高等生物的基因编辑的打靶系统，CRISPR/Cas9系统。该系统自2012年问世以来，其为生命科学以及生物医学研究注入了强大的动力，成为近年来的研究热点。2013年起，研究者们利用CRISPR/Cas9的DNA结合活性与内切酶活性，成功地在哺乳动物细胞中对基因组进行了编辑。在CRISPR/Cas9系统中，Cas9内切酶在单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA)的指引下，通过碱基互补配对原则，结合到基因组靶点位置，产生双链DNA断裂(DSBs)，从而引发细胞内的修复机制，即非同源末端连接途径(NHEJ)或同源重组定向修复(HDR)，在修复过程中发生碱基的缺失或插入，最终达到基因编辑的目的。Cas9蛋白结合靶点的关键是sgRNA(与靶点互补的序列约20bp)，仅改变sgRNA序列，即可对感兴趣的几乎任意基因组区域进行编辑。与应用较早的基因编辑技术如锌指蛋白核酸酶(ZFN)或转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)相比，CRISPR/Cas9系统具有设计灵活、成本低、操作简单、准确性高、可多位点同时打靶等优势。

sgRNA中文名称为向导RNA。原核生物中Cas9靶向切割DNA是需要两种小RNA--crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(transactivating crRNA)和靶序列互补识别的原理实现的。目前，通过基因工程手段将这两种小RNA融合为一种RNA，即sgRNA。sgRNA的主要功能是识别和结合到目标基因组DNA上，并介导Cas9蛋白切割DNA双链。因此，sgRNA能否做到高效靶向识别和结合目标基因是CRISPR-Cas9能否特异性编辑目标基因的先决条件，尤其是基因敲除和基因敲入，sgRNA的高效性对基因打靶的影响至关重要。因此，能够设计、制备出高效靶向目标基因的sgRNA是基于CRISPR-Cas9系统进行基因编辑的关键。

溶酶体中特定的酶发生先天性缺乏或缺陷会导致糖胺聚糖降解代谢障碍，使得代谢底物在体内异常累积，最终导致粘多糖贮积症(Mucopolysaccharidosis,MPS)。MPS是一种遗传代谢病，根据突变酶的类型以及代谢底物的不同，可将MPS分为八种类型，其中α-L-艾杜糖苷酶(α-L-iduronidase IDUA)功能异常可导致I型MPS，属于常染色体隐性疾病，在粘多糖贮积症中发病率较高。α-L-艾杜糖苷酶功能异常，使其不能有效分解硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素，导致这两种物质在角膜、瓣膜、肝、脾、软骨等组织异常堆积，从而导致全身性的、多器官、多系统症状。患者临床表现为尿液中常有大量粘多糖排出、智力低下、特殊面容、骨骼畸形、肝脾肿大以及角膜混浊等等症状。I型MPS是致残率和致死率非常高的遗传病，然而目前尚无良好治疗办法。