[发明专利]一种转基因玉米核雄性不育保持系及应用

说明书

本发明公开了一种转基因玉米核雄性不育保持系及应用，所述保持系是将外源T‑DNA载体导入玉米基因组构建而成，导入的外源T‑DNA中除了雄性核不育的育性恢复基因以外，还包含如下3种功能片段中至少2个功能片段：1)在种子胚乳中表达一种荧光蛋白质的表达框；2)一种可以抑制玉米抗除草剂基因CYP81A9表达的DNA片段；3)一种可以抑制玉米胚乳特异表达的细胞壁转化酶InCW2表达的DNA片段。本发明同时利用上述三种区分转基因与非转基因方法中至少2种方法，进一步降低仅仅依靠一种区分(或选择)方法可能导致的错误。

(一)技术领域

本发明涉及一种转基因玉米核雄性不育保持系及其应用。

(二)背景技术

杂交优势的利用给粮食的增产最重要的技术之一。玉米生产中通常通过2个自交系杂交制备杂交种子。杂交种子比较自交种子在生产上更加具有产量、抗性等方面的优势。在生产上目前大部分的杂交种子的生产仍然通过人工或者机械去雄的方法，成本高，工作量大。而且在生产杂交种的过程中由于环境的变化可能导致去雄完成后植株又雄穗化，或去雄不完全，从而导致母本自交授粉，影响杂交种子纯度。

雄性不育系统提供了简单高效的制备杂交玉米种子的手段。比较成熟的杂交技术体系是基于核-质互作雄性不育(CMS)自交系的三系杂交制种体系。该技术包括3个主要材料：1)不育系：雄性不育材料；2)保持系：可以为不育系提供花粉，使不育系的后代仍为不育系；3)恢复系：可以恢复不育系的育性。不育系与恢复系杂交产生F1，即用于农业生产的杂交种。更具体的说，核-质互作不育型，表现为核-质互作遗传。不但需要细胞质有不育基因S，而且需要细胞核里有纯合的不育基因(rf/rf)，二者同时存在，方能使植株表现为雄性不育。CMS三系杂交制种体系存在恢复系比较难找、技术体系复杂等缺陷，在玉米制种上推广面积仍然比较小。

利用核基因隐性不育基因是玉米杂交制种的另外一个可能的技术路线。控制雄性不育的核基因隐性纯合(ms/ms)植株才会表现为雄性不育，由于雄性不育植株无法自交，因此只能通过杂合植株(Ms/ms)与其杂交，才会得到雄性不育植株(ms/ms)。但是在同一果穗上雄性不育籽粒(ms/ms)与可育的杂合籽粒(Ms/ms)同时存在，无法简单通过物理方法分辨。

目前一种利用隐性核不育基因制备杂交玉米种子的新方法已经报道(Wu et al.,Plant Biotechnology,14:1046-1054；An et al.,Molecular Plant 12,343-359；Wu etal.,Shukla et al.,Molecular Biotechnology 59,445-457；美国专利7,612,251)。这种方法利用转基因的不育保持系制备非转基因的核雄性不育玉米种子。这个方法的技术要点是：转基因玉米保持系是在一个隐性核不育纯合系(如ms45/ms45)中导入了包含如下表达框的外源DNA：1)一个正常野生型的雄性育性基因(例如，Ms45)，其功能是互补导致雄性核不育基因(如ms45)从而挽救育性；2)一个种子颜色的标记基因(荧光蛋白质基因)；3)一个在花粉中表达的α-淀粉酶基因，导致转基因花粉因为没有淀粉而不能萌发。这个技术体系中纯合隐性不育基因(如ms45/ms45)被转基因导入的野生型基因(如MS45)互补而表现为雄性可育。同时由于转基因的花粉因其表达的α-淀粉酶而不能萌发，因此外源基因是不能纯合的。不带外源DNA的50％花粉(非转基因)能够成功授粉于纯合的核性不育(如ms45/ms45)的雌配子，从而获得雄性不育玉米种子。这些种子可以作为玉米杂交制种的母本。由于导入的外源DNA包含一个在胚乳中表达的荧光蛋白质基因，包含有外源DNA并且可育的种子因此可以与不包含外源DNA的雄性不育种子可以利用荧光特征而区分。这种技术可以简化玉米杂交制种的程序，降低成本。